支气管哮喘小鼠气道反应性无创检测方法的建立.doc

支气管哮喘小鼠气道反应性无创检测方法的建立 李斌恺 　 赖克方 　 洪燕华 　 王法霞 　 陈如冲 　 林少建 　 钟南山 　　 【摘要】 　 目的 　 目前国内对支气管哮喘 (简称哮喘) 小鼠的评价多数仅立足于气道炎性指标 ,不能完全反映哮喘的病理生理特征 。 本所率先从国外引进了小动物无创检测和有创检测肺功能仪 。 无创法检测时小鼠不必麻醉 ,而且每次可以同时检测多只小鼠 ,具有较大的优越性 ,但能否取代有创法尚需更多的数据 。本研究旨在建立无创检测小鼠气道高反应性的检测方法 ,并与有创检测方法进行比较 。 方法 　 根据动物模型和气道反应性检测方法不同 ,动物分为 : ① 无创哮喘组 ; ② 无创对照组 ; ③ 有创哮喘组 ; ④ 有创对照组 。 采用卵白蛋白致敏和激发 ,建立 BALB/ c 小鼠哮喘模型 ,生理盐水作为对照 ,分别用无创和有创的方法测定气道反应性 。 哮喘动物雾化吸入0 . 2～50 g/ L 倍增浓度的乙酰甲胆碱 ( Mch) ,测定相应浓度下的增强呼气间歇 ( Pe nh) 值或气道阻力 ( RL ) 值等指标 。 将小鼠吸入 Mc h 后 RL 或 Penh 增加 2 倍的激发浓度以 PC100 来表示 。 所有动物都行支气管肺泡灌洗 , 收集灌洗液 , 涂片染色后分类计数 。结果 　 无创哮喘组 PC100 均 ≤6 . 25 g/ L ,对照组 PC100 均 ≥ 12 . 5 g/ L 。 其 Lo g2 ( 10 PC100 ) 值 ( 5 . 36 ± 0 . 84) 显著低于对照组 ( 7 . 97 ± 0 . 82)( P < 0 . 01) 。 无创哮喘组从 Mc h 浓度3 . 12 g/ L 开始 , 其 Pe nh 值明显高于对照组 。有创哮喘组 RL 值从Mc h 浓度0 . 39 g/ L开始就明显高于相应对照组 ( P < 0 . 05) 。 无创组与有创组的气道反应性相关系数 R = 0 . 96 ( P < 0 . 01) 。 无创哮喘组和有创哮喘组的嗜酸粒细胞分别为 ( 54 . 00 ± 5 . 96) % , ( 55 . 93 ± 5 . 92) % ,显著高于各自对照组的 ( 0 . 38 ± 0 . 52) % , ( 0 . 63 ± 0 . 74) %( P < 0 . 01) 。 结论 　 本研究表明以 Penh 为主要测定指标的无创方法 ,可以成功检测哮喘小鼠气道高反应性 。 【关键词】 　 小鼠 ;气道反应性 ; 支气管哮喘 ;增强呼气间歇 ; 无创检测 　　 【Ab st ra ct】 　 Objective 　Most of t he evaluation on asthmatic mouse model only based on the airway inflammation , not fully reflecting its pathophysiology. Noninvasive method of measuring bronchial hyper responsiveness can detect several conscious mice in one time , but whether it can replace the invasive technique needs more data to be identified. This study aims to establish a non-invasive detection of mouse airway hyper responsiveness ,comparing with the invasive method. Methods 　 According to different ways of detection , mice were divided into four groups : non-invasive asthma group , non-invasive control group ,invasive asthma group and invasive control group . Mouse was sensitized and challenged with ovalbumin ( OVA) for asthmatic model . The mice were challenged with increasing concentrations of methacholine aero sol from 0 . 2 250 g/ L ,and the airway resistance was measured. Enhance pause ( Penh) or airway resistance ( RL ) was taken for each group . The dose of methacholine causing 100 % increase of respiratory resistance was defined as PC100 . The PC100 values were converted into Log2 ( 10 PC100 ) for statistical analysis. Bro nchoalveolar lavage cytology was performed to evaluate the airway inflammation. Results 　The PC100 of non-invasive asthma group was ≤6 . 25 g/ L , and the non-invasive control group’s ≥12 . 5 g/ L . I t s Lo g2 ( 10 PC100 ) value was significantly less than that of control group , ( 5 . 36 ± 0 . 84) vs ( 7 . 97 ± 0 . 82) ( P < 0 . 01) . The Penh value of non -invasive asthma group began significantly increasing when the concentration of Mch was 3 . 12 g/ L . The RL value of invasive asthma group was increasing at the beginning of 0 . 39 g/ L ( P < 0 . 05) . The coefficient rate of two groups was 0 . 96 ( P < 0 . 01 ) . The EOS ( %) of non-invasive asthma group or invasive asthma group was 54 . 00 ± 5 . 96 , 55 . 93 ± 5 . 92 respectively , significantly larger than that of control group ( 0 . 38 ± 0 . 52 ,0 . 63 ± 0 . 74 , P < 0 . 01) . Conclusions 　This study shows that single-chambered barometric whole-body plethysmography as a non- invasive lung function test can success fully detect airway responsiveness in asthmatic mouse model . 【Key words 】　Mice ; Airway hyper responsiveness ; Bronchial asthma ; Enhance pause ; Noninvasive method 从最早的电刺激离体气管平滑肌收缩能力测定 ,到现在的无创单腔整体体积描计,国外在对动物气道反应性的测定技术上经过了漫长的发展历程 。 而目前国内在对支气管哮喘 ( 简称哮喘) 小鼠的评价上多数仅仅立足于气道炎性指标 ,在气道反应性的检测方面近几年才起步 ,而且是用有创的方法。我所率先从国外引进了动物无创检测的肺功能仪 。气管插管后再测定动物气道阻力的有创法是评价动物气道反应性的经典方法 。 无创法则不需气管插管等繁琐的步骤 ,在动物处于自然状态下就可以直接测定其气道反应性 ,而且每次可以同时检测多只小鼠 ,具有较大的优越性 ,但能否取代有创法尚需更多的数据 。 因此 ,我们有必要探讨其与有创法的相关性 ,判定其是否能够有效检测动物的气道反应性 ,以期建立哮喘小鼠气道反应性的无创检测方法 。 材 料 与 方 法 一 、 仪器与试剂 仪器 : 本实验采用美国 B u xco 公司小鼠无创肺功能仪和有创肺功能仪 , 是目前国际上通用的小鼠肺功能检测仪器 ,主要包括体描箱 ,压力传感器 ( 流量传感器) ,信号放大器和雾化器等 。 其工作原理是 ,将乙酰甲胆碱 ( met hac holi ne , Mc h) 或生理盐水 ( N S) 等通过雾化器雾化入体描箱内 ,箱内小鼠吸入雾化气体后呼吸运动的改变引起箱内压力 、 流量产出相应的变化 ,连接于体描箱的压力传感器 ( 流量传感器) 将采集到的信号传至信号处理系统 ,并在信号放大器作用下转化为呼吸动力学各指标值 。 两套肺功能仪中 ,无创肺功能仪具有 6 个体描箱 ( 也有配置更多的) ,相应的传感器可以将各个箱内压力 、 流量的变化同步传至信号处理系统处理 ,因此可以同步为多只小鼠进行肺功能检测 。 主要试剂 : 鸡卵白蛋白 ( OVA ) ( Ⅴ 级 , 美国 S i gma 公司) , 氢氧化铝凝胶 ( 美国 S i g ma 公司) , Mc h ( 美国 Si gma 公司) 。 二 、 实验动物及分组 实验动物 : SP F 级 BALB/ c 雌鼠 ,5～6 周龄 ,体质量 18～20 g ,购自广州中医药大学实验动物中心 ,并在该中心饲养 。 饲料为去 OVA ( 不含鸡蛋) 的特殊食物 。 饲养环境符合 SP F 实验动物级环境设施标准 。分组 : 根据动物模型和气道反应性检测方法不同 ,分为 : ① 无创哮喘组 ; ② 无创对照组 ; ③ 有创哮喘组 ; ④ 有创对照组 。 其中 ,无创哮喘组 、 有创哮喘组每组 10 只小鼠 ; 无创对照组 、 有创对照组每组 8 只小鼠 。 三 、 哮喘模型的建立方法 实验第 0 天 、 第 7 天和第 14 天行腹腔注射致敏 :模型组每次给予 20μ g OV A + 150μ l Al (O H) 3 + 50 μ l N S( 100 mg/ L ) 混悬液 ; 对照组给予 200 μ l N S 。 实验第 28 天 、 第 29 天和第 30 天行滴鼻激发 ; 模型组每次给予50 μ l OV A2 N S ( 2 g/ L ) 滴鼻 ,对照组给予 50 μ l N S 。 四 、 检测的指标及原理 无创组用体积描记法测定增强呼气间歇 ( e n ha nce d p a u se , Pe n h) 如图 1[ 1 ]所示 : 曲线反映的是体描箱内小鼠呼吸时的压力变化 ; 曲线上部分为呼气相 ,下部分为吸气相 ; 气流受限时 , 曲线的呼气相部分明显延长 ,呈现阻塞性通气功能障碍时特有的呼气末凹陷 ,呼气相延长的程度反映了气流受限的程度 ,定义为呼气间歇( Pa u se) ,用吸气峰流速 (p ea k i n