血管紧张素Ⅰ放射免疫分析方法(固相抗体法)的建立.doc

【摘 要】目的：采用固相抗体包被方法，建立血管紧张素ⅰ放射免疫分析方法。方法：通过对抗体包被步骤、抗体稀释浓度、反应时间、反应体积等条件进行选择，建立新的分析方法，并进行方法学鉴定。结果：本项工作所建立的分析方法测量范围为100-7800pg/ml，灵敏度为42.2 pg/ml。批内、批间变异均小于10%，回收率为90.3%―102.2%。结论：本项工作所建立的固相抗体方法与原有分离试剂分析方法相比，具有操作步骤少、反应时间短等优点，更加方便临床检测。 　　【关键词】血管紧张素ⅰ 固相抗体法 放射免疫分析 　　1引言 　　采用固相抗体包被聚苯乙烯试管，并对抗体包被条件进行了研究，建立了血管紧张素ⅰ放射免疫分析法。结果表明在2―8℃下过夜包被，抗体滴度在1：9万 时，制备的包被管用于血管紧张素ⅰ放射免疫分析，结合达到最大；不同滴度下包被，包被温度和时间对制备的包被管的影响不同；不同的反应时间以及125i―ai和标准品加样量的不同也会对包被管的结合产生影响。血管紧张素ⅰ包被管法放射免疫分析灵敏度为（42.2pg/ml）；回收率为（90.3%―102.2%）；批内、批间变异系数分别为（5.1%―9.0%）和（8.3%―10.2%）。 　　2实验材料 　　血管紧张素ⅰ多克隆抗体由原子高科医学二部提供；聚苯乙烯六角试管（mm×mm）为（哪个）塑料厂产品；125i―ai及ai药盒标准品由原子高科医学二部提供；蛋白g填料亲合层析柱由美国进口；牛血清白蛋白（bsa）为上海生物制品厂产品。对照药盒由原子高科股份有限公司生产（国药准字：）。其他试剂均为分析纯。 　　3实验方法 　　3.1兔igg的纯化 　　采用蛋白―g柱进行亲合层析纯化，纯化后igg浓度由紫外分光光度法测定。 　　用包被缓冲液（0.1m ph9.5碳酸缓冲液）将兔igg配制10μg /ml。混合均匀后250？l /管包被，然后放2―8℃过夜，弃去包被管中第一层包被液，各管用500？l洗涤液（0.02 mol/l，ph7.4磷酸缓冲液）清洗1次。待包被第二层（兔二抗）用。 　　3.2用驴抗兔二抗进行第二层包被 　　用0.05 mol/l，ph7.4磷酸缓冲液（含1%bsa）将兔二抗配成合适的浓度后250？l /管包被，然后放2―8℃过夜，弃去包被管中第二层包被液，各管用500？l洗涤液（0.02 mol/l，ph7.4磷酸缓冲液）清洗1次。待包被第三层（兔一抗）用。 　　3.3不同滴度兔抗（一抗）包被实验 　　将兔抗用封闭液配制成1：2万，1：4万，1：6万，1：8万，1：9万，1：12万，1：14万，1：16万不同的滴度，分别加250？l于已经包有兔二抗的包被管中，每个滴度做双复管，之后在每管中加入100？l 125i―ai，然后放2―8℃静置过夜；弃去管中溶液，各管用500？l洗涤液清洗3次后测量各管放射性计数，计算其结合率，选择合适的抗体滴度作为工作稀释度。 　　3.4温度，时间对抗体包被的影响 　　用封闭液将兔抗（一抗）稀释成不同滴度（1：2万，1：4万， 1：8万，1：9万，1：12万，1：14万），分别在不同温度和时间下包被，实验中抗体加入体积均为250？l，各管均加入100？l 125i―ai，将不同条件下制备的包被管进行放射免疫结合分析，并对结果进行比较。 　　3.5抗体包被管的制备 　　每管加250？l兔igg溶液（10μg /ml），2―8℃静置过夜，弃溶液，各管加500？l洗涤液清洗1次后加入250？l驴抗兔二抗溶液，2―8℃静置过夜，弃溶液，各管加500？l洗涤液清洗1次后加入250？l兔一抗溶液（1：9万），2―8℃过夜，弃溶液，各管加500？l洗涤液清洗1次，弃溶液，自然晾干，密闭，于2―8℃下保存。 　　3.6体系反应时间，温度的选择 　　设计不同的反应条件为37℃1h，37℃3h，4℃15h，4℃24h。 　　3.7加样量的选择 　　设计4组不同的加样量为：第一组125i―ai加100？l，标准品加100？l；第二组：125i―ai加100？l，标准品加50？l；第三组125i―ai加50？l，标准品加100？l；第四组125i―ai加50？l，标准品加50？l。 　　3.8放射免疫分析程序 　　标准品（或样品、质控血清）100？l和标记物100？l加于包被管中，混匀，然后放2―8℃静置过夜（15―24h），弃溶液，加500？l洗涤液清洗2―3次，测各管放射性计数。 　　3.9方法学考核 　　灵敏度：以20个零标准管的计数平均值―2s对应的剂量值表示。准确度：任取一份血浆标本，测定基值后分别加入0pg/ml ，250pg/ml，625 pg/ml，1560 pg/ml的标准品，再次测定，计算回收率。精密度：测定批内和批间变异系数（cv%）。健全性：将一份高浓度样品稀释成1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64分别测定其含量。经回归处理后成一条直线，y=1.000 x +0.4673，r=1.000。 　　4结果与讨论 　　4.1不同滴度的兔抗（一抗）包被实验 　　不同滴度抗体包被实验结果列于表1，表1结果表明，当抗体滴度为1：16万―1：8万时，随着抗体滴度的减小，包被管的结合率逐步升高；当抗体滴度为1：8万―1：2万时，包被管的结合率没有出现明显升高，基本保持同一水平。所以在不影响放免药盒灵敏度的前提下，选择1：9万作为抗体的工作稀释度，用于包被。（该处可以作图，不列表） 　　4.2包被时间，包被温度对包被的影响 　　结果列于表2由表2可知，包被温度和包被时间对包被管免疫结合的影响依赖于包被时加入抗体的浓度。当加入抗体的滴度为1：2万和1：4万时，升高包被温度使包被管的免疫结合增加，而延长包被时间对包被管的免疫结合无显著影响；当加入抗体滴度为1：14万 　　和1：16万时，升高包被温度包被管的免疫结合显著减少，原因可能是抗体在低浓度时较不稳定，包被过程中较高的温度使抗体的活性损失；当加入抗体滴度为1：8万和1：9万时，包被温度对包被管的免疫结合影响减少，且包被时间从3h延长到24h，包被管的免疫结合有所增加。此结果提示，在较高温度下，采用较大抗体浓度，只需要较短的包被时间，即可获得具有较高免疫结合的抗体包被管。但考虑到实际生产中低成本和包被工艺简便性的需要，在满足免疫分析要求的前提下，选择抗体滴度为1：9万，2―8℃过夜（15―24h）作为包被条件。 　　4.3体系反应时间、反应温度的选择 　　结果列于表3，由表3可知，当反应温度在37℃时，延长反应时间从1 h到3 h，免疫分析的最大结合s0%从46.4%增加到59.2%，但是标准曲线的最高浓度点的抑制不好，分别为37℃1 h为16.1%；37℃3 h为14.6%，这可能是反应不充分造成的。而反应温度在2―8℃时，延长反应时间从15―24h，免疫反应的几个指标都比较好，同时也克服了37℃反应曲线抑制不好的问题，所以在考虑实际操作简便，节省时间的需要，在满足免疫分析要求的前提下，选择反应条件为2―8℃过夜。 　　4.4加样量对免疫分析的影响 　　结果列于表4由表4可知，当加入标记物的量都是50？l时，加入100？l标准品的包被管的免疫分析主要指标最大结合s0%，曲线的抑制都好于加入50？l标准品的包被管免疫分析主要指标，加50？l标准品的包被管的曲线抑制不好，标准曲线最低浓度点的b/b0%为94.1%，最高浓度点的b/b0%为14.6%。但是考虑到加50？l标记物的各管计数都比较低，还有计数器的效率等问题，所以标记物的加样量就不采用50？l加样。当加入标记物的量都是100？l时，加入100？l标准品的包被管的免疫分析主要指标最大结合s0%，曲线的抑制都很好，并且各管的放射性计数也比较高，各种因素对测量的影响也相对较小。当加入50？l标准品时，标准曲线出现倒勾现象，曲线的最低浓度点b/b0%为101%，出现这种情况就是因为标准曲线的各包被管中加入 的非标记抗原的量不够造成的。所以通过对数据的比较，选择比较合适的加样量为标记物加100？l，标准品加100？l。 　　4.6方法学鉴定 　　（1）灵敏度。以20个零标准管计数的平均值-2s对应的剂量值表示，灵敏度为（42.2pg /ml）pg/ml。 　　（2）准确度 已知量的一份血浆样品中分别加入4种不同剂量的标准品进行测定，结果列于表5。由表5可知本法回收率为90.3%―102.2%，说明本法准确性较好。 　　（3）精密度 　　采用本方法对3份含有不同浓度的人血浆样品重复测定，计算批内、批间变异系数，结果列于表6。由表6可知，批内变异系数为（5.1%―9.0%）；批间变异系数为（8.3%―9.5%）。 　　（4）健全性（同质性）。将一份较高浓度的血浆样品倍比稀释成1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64，测定结果列于表7。由表中数据计算其相关方程为：y=1.000 x +0.4673，r=1.000 　　实验结果表明研制的血管紧张素ⅰ放射免疫分析法（固相抗体法）的健全性良好。 　　5结语 　　（1）采用 固相抗体 包被聚苯乙烯试管的包被条件为：选择抗体滴度为1：9万，2―8℃过夜（15―24h）。在此条件下所得包被管用于血管紧张素ⅰ放射免疫分析，可达到最大结合。 　　（2）用该包被管进行血管紧张素ⅰ放射免疫分析时，其灵敏度为（42.2pg /ml）；回收率为（90.3%―102.2%）；批内、批间变异系数分别为（5.1%―90%）和（8.3%―10.2%）。