血清中提取IgM方法和蛋白连接方法.doc

血清中提取IgM方法和蛋白连接方法 血清中提取IgM方法 SDS-PAGE: 12% Tris HCl gel Lane 1. 5 μg IgM (reduced/heated) Lane 2. 10 μg IgM (reduced/heated) Lane 2. 20 μg IgM (reduced/heated) Lane 3. 5 μg IgM (non-reduced/no heat) Lane 4. 10 μg IgM (non-reduced/no heat) Lane 5. 20 μg IgM (non-reduced/no heat) 一、 人IgM的基本性质 总分子量970kDa，重链μ链分子量68kDa，沉降系数19S，pI=5.1-7.8，结构域5个，血液含量1.5mg/ml，半衰期10天，血清中总球蛋白比重10%，碳水化合物12%。 二、 盐析法 盐析法 （1）饱和硫酸铵溶液的配制：称（NH4）2SO4（AR）400～425克，以50～80℃之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。冷却后以浓氨水（15N　NH4OH）调PH至7.4。配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。 （2）萘氏试剂配制：称HgI 11.5克，KI8克，加蒸馏水至50ml，搅拌溶解后，再加入20%NaOH 50ml。 （3）0.02M，PH7.4磷酸盐缓冲盐液（Phosphate Buffered Saline PBS）配制：贮存液 A液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O 71.64克，加蒸馏水至1000ml； B液： 0.2M NaH2P4：NaH2P4·2H2O 3.12克，加蒸馏水至1000ml； 应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。 （4）0.1M，PH7.4磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer P配制：将上述A液取81ml与B液19ml混合，再以蒸馏水对倍稀释即成。 （5）20%磺基水杨酸。 取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50% 4℃，3h以上，使其充分沉淀3000rpm离心20min，弃上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml置4℃3h以上，[此时，(NH4)2SO4的饱和度为33%]。重复上述过程1~2次。末次离心所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02% mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。 影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。 影响盐析的因素：影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。 （1）蛋白质的浓度 盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。 （2）离子强度 各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。 （3）盐的性质：最有效的盐是多电荷阴离子。 （4）PH值：一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。 （5）温度：盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。 （6）蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。 三、冷酒精沉淀法 1.血清加3倍体积的蒸馏水，调节 pH至7.7(±)冷却到0℃。在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20℃）到最终浓度为20%保持在-5℃。产生的沉淀A含大多免疫球蛋白。 2.沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/L NaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸调节 pH到5.1，产生的沉淀（B），包括大部分的IgA和IgM，IgG在上清液内。 3.从沉淀（B）可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀（B）悬浮在0℃ 水中，调节 pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。调节上清液离子强度到0.01～0.0075, pH5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%，保持在–2℃或-3℃低温，所得的沉淀（B-B）主要含IgA和IgM。 （一）材料 1．血清 2．葡聚糖凝胶G200 3．洗脱液0.01Mol/L pH7.4PBS（0.14Mol/L NaCl或0.1Mol/L pH8.0 Tris－HCl+0.14Mol/L NaCl）。 （二） 操作方法 选取2.50cm×90cm层析柱，用葡聚糖凝胶G200装柱，平衡后，直接加血清样品10ml或硫酸铵粗提制品，洗脱液洗脱，流速0.25ml/min，分管收集，测OD280值，第一峰即为IgM。将第一峰的数管混合，浓缩、鉴定。 不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同，见下表。从沉淀（B）可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀（B）悬浮在0℃ 水中，调节pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。调节上清液离子强度到0.01~0.0075，pH5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%，保持在-2℃或-3℃低温，所得的沉淀（B-B）主要含IgA和IgM。 表 从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件 物 种 pH 沉淀条件 IgG产量 酒精浓度（%） 离子强度 人  5.1 15. 0.01 65 山羊 5.2 0 0.01 65 家兔 5.2 10 0.01 70 大鼠 5.0 15 0.01 50 豚鼠 5.1 15 0.01 70 四、优球蛋白沉淀法 将腹水在4°C蒸馏水中透析8～15 h，12 000 r/min离心15 min，收集沉淀蛋白，重新溶解于1 mol/L NaCl/0.1 mol/L Tris-HCl pH8.0的缓冲液中，立即进行凝胶过滤或-20℃冻存。凝胶过滤：先用10 mmol/L Tris-HCl pH8.0缓冲液平衡SuperdexTM-200 prepgrade 预装柱，将硫酸铵沉淀或优球蛋白沉淀收集的1 ml样品上样,用1.5 mol/L NaCl/10 mmol/L Tris-HCl pH8.0的缓冲液进行洗脱，洗脱流速控制在1～2 ml/min。收集的洗脱峰分装冻至-20℃。 五. 辛酸-硫酸铵法从人血清中纯化IgG(选定方法) (一)、实验原理 辛酸-硫酸铵法分两步进行。第一步用辛酸沉淀杂蛋白，辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下可沉淀血清或腹水中的白蛋白或其他非Ig蛋白质；第二步利用硫酸铵盐析将Ig沉淀下来，操作步骤如图3-10所示。经SDS-PAGE电泳检测能得到电泳纯度较高的Ig。 (二)仪器、原料、试剂 磁力搅拌器、离心机、低温冰柜；抗血清（兔抗鸡血清）； (1) 乙酸-乙酸钠缓冲液：60mmol/L，pH4.0。 (2) 10×磷酸盐-NaCl 缓冲液（PBS）：100mmol/L PBS，pH7.4。称NaCl 80g、Na2HPO412H2O 29g、KCl 2g、KH2PO4 2g，加蒸馏水溶解，加入100mmol/L EDTA 20ml，用去离子水定容至l000ml。(3)  透析液 10mmol/L Na2HPO4-KH2PO4缓冲液，含15mmol/L NaCl，pH7.2。 (4) 硫酸铵。(5) 辛酸。 (三). 操作步骤 1、抗血清用4倍体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释，用0.1mol/L NaOH调至血清稀释液为pH4.5。 2、室温下边搅拌（磁力搅拌器或电功搅拌器），边缓慢滴加辛酸（25ml/L血清稀释液），滴加完后继续搅拌30min。 3、离心(10000r/min，30min)，收集上清液，弃去沉淀。 4、上清液用多层纱布过滤。 5、按1/10体积加入10×PBS，用5mol/L NaOH调至pH7.4。 6、上清液4℃预冷，计算溶液总体积，在4℃按277g/L加入硫酸铵粉沫（45%饱和度），边加边搅拌，加完后继续搅拌30min。 7、离心（5000r/min，15min)），弃去上清液。收集沉淀。 8、沉淀用少量透析液溶解（一般为血清体积的1/10），透析并更换两次透析液或用Sephadex G-50脱盐。 9、Ig溶液在50～55℃水浴中加热20min，离心(5000r/min，20min)，上清液-20℃保存或冻干保存。 二.免疫球蛋白偶联方法 (一)戊二醛二步标记法： a) 取兔抗TOX 10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中，加入25%戊二醛0.1ml，37℃温育2h后加入冰冷的分析纯的无水乙醇2ml，2500r/min离心沉淀10min~15min，倾去溶液。 b) 沉淀以80%乙醇4ml~5ml混悬，同上离心，倾去乙醇，将管倒置，使乙醇充分流出。 c) 沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，加入0.5ml~1ml 抗IgG抗体溶液(含抗体15mg左右)，放在冰箱内过夜后，加KH2 PO4，使近中性即可应用。