血凝仪器发展要点.doc

Sysmex株式会社CA系列全自动凝血分析仪 几乎所有检测血液凝固的现有基本原理都是在1900年的前半年提出的，但现代止血与血栓分析仪器的雏形出现于50年代。当时对于止血/血栓的检测完全依赖人工方式，由于这种方法不同检验员得到的测试结果差别较大，同时要求检验员具有很高的操作熟练程度，因此，迫切需要实现测试的自动化。在这种理念下，开发出了最早的运用电流法原理的半自动化操作仪，其主要还是模拟手工凝固时间的测定方法。60年代出现了光学浊度法的凝血仪。但是，血凝仪的真正发展与普遍使用乃是始于微电子技术、免疫化学技术迅速发展的70-80年代，使运用光学浊度法的血凝仪日趋完善。一系列血液凝固自动测试仪的开发，使得止血/血栓的检测更为准确、迅速，显著提高了实验的精度。     Sysmex株式会社（日本希森美康株式会社），原名日本东亚医用电子株式会社（TOA Medical electronics Co.LTD）,是一家集先进的血球计数仪、尿沉渣分析仪与凝血仪生产于一体的跨国公司，素以产品精湛、技艺超群而闻名于世。本公司致力于研究开发全自动凝血仪，并于1984年首次推出了CA-100凝血分析仪以来，有CA-3000、CA-4000、CA-5000、CA-1000、CA-6000、CA-500、CA-1500、CA-50及CA-7000等一系列CA产品陆续投放市场。公司生产的全自动凝血分析仪因品种繁多、性能卓越而受到广大检验工作者的普遍欢迎，能满足不同层次使用单位的要求，在众多同类产品中成为凝血机制检查的首选。尤其欣慰的是，Sysmex公司与Dade Behring 公司长期合作，实现了试剂优选的目标。强强联手，真正地将凝血机制的实验室检查推进到了一个崭新的阶段。以下对CA各系列产品作一介绍。     Sysmex公司在血液凝固分析仪器领域中最初上市的产品CA-100是一种单通道的半自动仪器。引进微电子技术后，对异常标本也能进行高性能的测试，同时具有操作简便的优点。因此，目前该技术仍应用于许多设备中。本仪器的测试原理采用了光学法中的散射比浊法，主要是根据待测样品在凝固过程中散射光的变化来确定检测终点。在该方法中检测通道的单色光源与光探测器呈90°直角，当标本中加入凝血激活剂时，起初在标本中并未发生很大的散射光变化，随着反应的进行，纤维单体的聚合作用加速，反应液产生白浊现象，从而使散射光强度增加。用超高辉度二极管（光源660nm）照射上述反应液，将90°角方向的散射光量转换为电信号，并将信号的变化描绘成凝固曲线，当标本完全凝固以后，散射光量不再变化。另外，仪器还采用了百分比终点测试法，即把标本中加入试剂后最初散射光量设为0%，把反应结束后不再变化的散射光量设为100%，并将与50%散射光量相对应的时间作为凝固时间进行测定。50%的部位是单位时间内散射光量的变化最为显著、纤维蛋白的单体聚合反应速度最快的部位。由于引入了百分比终点测试的方法，预先扣除了标本、试剂的本底，然后再检测由于凝固而致的散射光强度的变化，因此即使对于临床常见的最初光量水平较高的溶血性标本、黄疸、脂血标本，或者散射光强度较低的低纤维蛋白标本，均能进行更准确的测定，具有较强的抗本底干扰能力（图1）。所有CA系列的血液凝固分析法均采用了这种测试方法。 1985年和1986年公司相继开发了全自动血液凝固分析仪CA-3000和CA-4000。CA-3000不仅将检测部增加到8个通道，大大提高了处理标本的能力，而且还实现了投放试剂的全自动化。CA-4000通过安装具有冷却功能的取样器，实现了标本抽取和投放的全自动化。标本吸移管上设有液面感应器，因此，离心操作之后不必进行分离，在保持其原状态的条件下，只抽取上面的血浆，从而大大地减少了标本的前处理时间，使凝固测试变得更简便。      1990年Sysmex公司开发出全自动血液凝固分析仪CA-5000，它使直到当时CA系列一贯采用的试剂和血浆量（与人工测试法等量）半量化，大幅度地降低了检测成本。从此，试剂和血浆的半量化成为血液凝固分析领域里的主要趋势。另外，CA-5000还可同时测定5项参数，真正实现了高速处理。CA-5000的研制成功使Sysmex公司在国内凝固测试仪器领域中占据了领先地位。1992年，为实现仪器的中、小型化，公司又开发出将CA-5000进一步小型化的产品CA-1000。      在中国，广泛使用CA系列血液凝固分析仪是从1997年Sysmex公司开发的CA-6000开始的，下面对这一系列在中国应用最普遍的仪器作详细介绍。      CA-6000在凝固法的基础上有应用了发色底物法和免疫法测定原理。     一、基于发色底物法的测试系统用于酶的测定，它包括下列两种方法： 即在蛋白酶和发色底物进行一定时间的反应后——         1、用反应终止液使反应停止，将此时的吸光度作为绝对量用比色计测定，从而求出其活性量的终点法。     2、将一定时间内的吸光度变化量作为反应速度，从而求出其活性的动态法。     所需试剂种类及试剂添加量较少的动态法广泛应用于自动测试中。CA-6000 采用该种动态法进行全自动测试，其原理是：通过人工合成与自然凝血因子有相似的一段氨基酸排列顺序、还有特定作用位点的小肽，并将可水解产色的化学基团——对硝基苯胺（PNA）与作用位点的氨基酸相连。测定时由于凝血因子具有蛋白水解酶的活性，它不仅能作用于天然蛋白质肽链，也能作用于人工合成的肽链底物，从而释放出PNA基团，使颜色呈黄色，产生颜色的深浅与凝血因子活性成比例关系。通过光纤，从卤素灯光源将波长为405nm的光源射到受检标本，然后对透射光进行检测，求出一定时间内的吸光度变化，并根据标准校正曲线，计算出所测物质的活性百分比值。     二、免疫法采用乳胶凝集法。根据此法可测定FDP/FgDP和作为继发纤溶分子标记物之一的D-dimer。乳胶凝集法采用的是将与待测物质相对应的抗体包被在乳胶颗粒上，然后与被检物结合，形成抗原抗体复合物的乳胶颗粒凝集，使透射光强度发生变化。同时利用形成复合物的时间与抗原量之间的正比关系、凝集速度与抗原量之间的正比关系，从单位时间内颗粒凝集引起的光学变化量求出抗原量。运用免疫法，有时在分析过程中产生光量变化下降的前驱现象，CA-6000可以通过分析与反应初期的反应速度之比检测出这些现象。进行该测试时，通过更换发色底物单元的滤波器可以改变测试波长。用575或800nm的光照射标本，并检测透射光，求出单位时间内的吸光度变化。     除此之外，CA-6000的试剂定量采用精度更高的注射式代替了过去的泵式，试剂和血浆的搅拌方式改用更加可靠的电动机振动搅拌代替过去的试剂吐出搅拌，使混匀更充分，并能避免气泡的产生。这些措施显著地提高了数据的准确性，此后的CA系列产品均采用了这些方式。     1997年，Sysmex公司研制出能够进行凝固法和发色底物法全自动测试的 CA-500系列。这是一种可进行全自动测试的小型产品，虽然所测标本数目不多，但对于多项参数的测试非常有效，是一类“低成本、高效益、实行微量法测试”的台式化仪器。它不仅适用于常规筛选检查，也可用于确诊的精密检查，并可灵活运用于夜间急诊以及研究工作。CA-500系列主要包括四种机型：CA-510、CA-520、CA-530、CA-540。（区别见下表）   发射底物法装置 试剂冷却器 条形码识别器 CA-510 —— —— 选购件 CA-520 —— —— 有 CA-530 有 有 选购件 CA-540 有 有 有 该系列除了采用凝固法对PT、APTT、Fbg、TT四个基本检验项目进行测试外，CA-530/CA-540采用发色底物法对AT-Ⅲ进行测试，测试方法均为分离式实时随机方式，通过程序化软件，还可完成对其它项目的测试任务。在对纤维蛋白原定量时可选择经济实用的“PT演算法”和国际标准的CLAUSS法进行测定。自动稀释功能对于高浓度的纤维蛋白原或低浓度纤维蛋白原异常标本，可通过设定自动稀释比率获取准确的测试结果，这些都保证了结果的高精密度与高准确性。     CA-500系列在自动化方面，可以自动进行标本及试剂的取出与注入、预温和测试，装有10个试管的试管架可以简单地装进自动进样机，并且可以通过更换试管架来持续传送标本。自动稀释功能确保了纤维蛋白原测定的可靠性，而STAT位的设置，可以完成随时对紧急标本的优先测试；CA-500系列的低成本、高效益性表现在真正实现了全自动操作，大大节省了时间，提高了化验室的检验效率。该系列采用半量化测试与注射器吸引方式，从而降低了试剂的消耗。由于试剂托盘可移动，在测试前后均可将试剂放在冰箱里保存，同时CA-530/CA-540还配有试剂冷却功能，达到了节省试剂的目的；在安全性方面，由于融合了诸如自动进样、全封闭式检验以及自动处理试管等功能，从而大大降低了接触感染的危险性。试剂与样品针的撞针自动检测报警功能也增加了使用的安全性。     1998年，Sysmex公司为了提高CA-6000的操作性，通过改进程序，开发出了CA-1500，实现了多功能和高速处理。该仪器采用了凝固法、发色底物法和免疫法3种检测技术，测定血浆中的凝血、抗凝和纤溶的多项参数。凝固法原理检测时，由于先进的光学散射比浊法与百分比终点测试法相配合，解决了高脂、黄疸和溶血对凝固时间测定的干扰（见中华医学检验杂志1999年22卷第5期），并可测出低纤维蛋白原样品的凝固时间。在对纤维蛋白原浓度定量时可选择经济实用的“PT演算法”和国际标准的CLAUSS法进行测定。它采用了全自动多浓度稀释分析方法（Multi Dilution Analysis,MDA）,不同稀释度的测试结果所呈现的线性范围，由于标准曲线呈平行状态的平行线图象显示来支持，即平行线生物学分析功能，可以充分保证凝血因子分析结果的高度准确性，并有助于鉴别抑制物的活性状况。CA-1500除了采用X或L-J质控方法外，还采用了一种新型的多规则质控方法——Westgard方法，拥有20个质控文件。这些都使检测结果的可靠性方面有了保证。     CA-1500具有快捷的检测能力，检测PT时可达120个测试/小时，多项指标联合测定为80个测试/小时。它实现了全能的随机分析：在标准曲线制作、检测质控品和常规标本时，能对15项常见参数（PT、APTT、TT、Fbg、AT3、plg、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ、D-dimer）进行随即分析。另外，附设5个STAT专用检测位，可用于急诊标本的优先检测。同时具有自动再检功能、自动连锁筛选功能：对于结果超出实验室预设范围的标本，它可自行再（或无需）稀释后再检测。结果确实异常时，在综合分析的基础上，相应地自动进行下一步测试，以进一步提供异常标本的相关信息。打开或关闭的测试管可以同时设置在进样机上，而原始管免开盖穿刺式吸样，都大大提高检测效率和安全性。     CA-1500为一台开放式全自动凝血分析仪，表现在编程功能上的极具灵活性，可使用自行编制的测试程序来完成不同测试任务。而它拥有的通讯环境的广泛适应性则体现在供选配的ID条码阅读机、打印机和主机的种类的多样性上，如将CA-1500与全自动离心机标本架输送系统相连，可以形成自动化凝血检查系统，还可以在标准系统上再添一台CA-1500，进一步提高标本的处理能力。     据上海瑞金医院实验研究表明，CA-1500血液凝固分析仪在应用Dade公司试剂系统的条件下，具有很高的批内和批间检测重复性，良好的测定线性和较强的抗生物干扰能力以及与ACL-3000plus血液凝固分析仪的良好相关性。它不但能满足目前临床常规血液凝固指标检测的需要，而且对设定新的止血和血栓检测指标也具有较大潜力。（见中华医学检验杂志1999年22卷第6期）     1999年，Sysmex公司推出了CA-100的改型产品CA-50和目前世界上性能最优越，综合采用各种最新