细菌及细胞电镜观察样品制备方法.doc

细菌样品冷冻干燥制样方法 1) 取样：取大量样品离心（转速 3000r~4000r），去除上清液，加入适当 PH（7.2~7.4）的0.1 M PBS清洗三遍；清洗时菌体温柔悬浮。 2) 固定：2.5%戊二醛固定3h（此步时间非绝对，1~12h都可），用PBS清洗两遍，每遍10min。再用纯水清洗两遍。 3) 梯度脱水： 用乙醇的水溶液按30%、50%、70%、80%、90%的浓度梯度对样品进行脱水，每步15min，之后在100%乙醇的水溶液中脱水 15min×2 次；再将样品置于乙醇和叔丁醇 1:1混合液中15min；最后置样品于叔丁醇中 15min×2次。（此步也可以尝试不做） 4) 冷冻干燥：滴加处理好的样品于5*5 mm的盖玻片上，置-80度冰箱冷冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。 5) 电镜观察： 样品充分干燥后，进行扫描电镜观察。 2.5%戊二醛： Step 1: 0.2M磷酸缓冲液的配制：（0.1M的就是稀释2倍）取50mL定容100mL --------------------- 磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O）　　　　2.6克 磷酸氢二钠 (Na2HPO4.12H2O)　　　　29克 双蒸馏水 　　　　　　　　　　加至500毫升 pH调至7.4 Step 2: 戊二醛固定液的配制： --------------------- 25% 戊二醛　　　　　　1ml 双蒸馏水　　　　　　　4ml 0.2mol/L磷酸缓冲液　　5ml 戊二醛最终浓度　　　　2.5% pH值7.3-7.4