细胞工程知识点陈永勤.doc

第一章 植物组织培养简介 1.细胞工程（Cell Engineering）：在体外对生物的细胞进行生长与分化的调控、遗传重组与改良，使其生产出人类所需要的产品。 2.细胞全能性假说是开展植物组织培养研究的理论基础；验证细胞全能性假说是开展植物组织培养研究的动力。 3.细胞分裂素与生长素的浓度比值决定着愈伤组织根或芽的形成。细胞分裂素/生长素的比值： 高：形成芽；低：形成根；相当：愈伤组织增殖，但不分化。 4.植物组织培养在植物性状改良上的应用: ①.胚培养可克服远源杂交不孕的困难； ②.花药（花粉）培养可大大缩短育种年限； ③.原生质体融合技术可克服有性杂交不亲和，创造远源杂种、甚至新的物种； ④.单细胞培养技术可用于突变体的筛选。 第二章   植物组织培养的设施 1.培养室所需要的设备： ①.培养架:培养架的设计既要考虑充分利用培养室的空间，也要考虑取放材料方便。 ②.加温/降温设备：空调 ③.光照和控光设备。分为光培养室和暗培养室。光培养室常用日光灯照明，并安置控制光照时间的自动开关。 2.瓶盖、瓶塞、或者封口膜的透气性能对材料的培养有显著影响，透气性能不好的，容器中湿度高（饱和），容易导致植物材料出现玻璃化（生理病态，植物材料呈水渍状，深绿色，刚脆，无继续培养的价值） 第三章 植物组织培养基 1.培养基的重要性: 1)植物材料生长的营养来源； 2)调节植物材料生长与分化的主要途径。 2.培养基的组成： ①.水：要求纯净。应用蒸馏水、去离子水，而不用自来水。 ②.无机营养成分： 植物生长发育需要有16种必需元素：大量元素：C, H, O, N, P, K, Ca, Mg, S；微量元素：Fe, Cl, Cu, Mo, B, Zn, Mn。不同培养基的无机盐（特别是大量元素）的浓度差异很大。 ③.有机营养： 有机营养（有机成分）：维生素和氨基酸的总称。 常用：肌醇、烟酸、维生素B6、维生素B1和甘氨酸等。 其它维生素：维生素M（叶酸）、维生素B2（核黄素）、泛酸钙等。 其它氨基酸：谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺等 ④.碳源：最常用的糖是蔗糖(sucrose)，但也有时用葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)或其它的糖(lactose, maltose)，有时几种糖混用。糖是营养物质，但不是越多越好。培养基中糖的用量大多在10—60g/L，一般为20—30 g/L。 ⑤.植物生长物质：植物生长物质是植物激素和植物生长调节剂的总称。 植物激素：植物合成的、微量就有显著生理效应的物质。 植物生长调节剂：人工合成的、具有植物激素相似作用的物质。 ⑥.凝固剂：在植物组织培养中，琼脂（agar）是最常用的凝固剂，用量为6-12g/L。另外还有phytagel, Gelrite, 4g/L。 ⑦.有机附加物：水解酪蛋白、水解乳蛋白、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物：用量为0.1-10g/L，一般为0.5-3 g/L。椰子汁：100-200ml/L。 ⑧.其它物质：防止与减缓植物材料褐化的物质： 1）抗氧化剂：抗坏血酸（Vc）、L-半光氨酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等。 2）吸附剂：活性炭、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。 活性炭吸附无选择性；改善培养效果、促进生根。 PVP专一吸附酚类物质。 3.植物激素在植物组织培养中的作用： ①生长素：(1) 促进细胞分裂、增殖，导致愈伤组织的形成(2,4-D>NAA>IAA, IBA)；(2) 控制器官的分化，诱导根的形成。（IBA>NAA>IAA) ②细胞分裂素:促进细胞分裂、增殖，导致愈伤组织的形成；控制器官的分化，诱导芽的形成和增殖。 ③赤霉素:赤霉素最显著的作用是促进细胞的伸长，也有打破种子休眠的作用。在植物组织培养中使用赤霉素主要是促进芽或茎的伸长。赤霉素对热不稳定，故不宜用高温法消毒。 ④乙烯:乙烯促进果实成熟，加速植物衰老。植物组织培养极少使用乙烯（乙烯利），相反，而是尽量控制乙烯的产生。 ⑤脱落酸:脱落酸是促进植物衰老的激素，植物组织培养很少用。在胚状体（embryoid）的诱导和培养中常常使用脱落酸，促进胚状体的成熟。 4.植物激素母液的配制:对于生长素类激素，也可用稀碱助溶；对于细胞分裂素类激素，可用稀酸助溶。激素母液也应在低温下保存。 5.高温消毒时应注意的问题： ①一定要先排气10 min，否则不能消毒不彻底； ②高温消毒后，培养基的pH值会下降0.2—0.5个pH单位； ③高温消毒过程中，培养基中有些物质会被破坏或发生沉淀。如蔗糖会水解成葡萄糖和果糖，葡萄糖变成葡萄糖酸等；有些物质甚至几乎完全被破坏，如赤霉素、玉米素等。物质破坏程度与消毒时间和压力有关。 6.过滤灭菌法:由于过滤消毒不会破坏培养基的成分和改变培养基的pH值，所以在原生质体培养、单细胞培养时常用过滤消毒法对培养基进行灭菌。如果培养基中要使用一些热不稳定的物质，如ZT、GA3、核黄素等，则这些物质也要用过滤消毒法灭菌。 第四章 外植体的表面消毒 外植体(Explant)——用于建立无菌培养的起始植物材料。 表面消毒(Surface sterilization)——（用消毒剂）杀死外植体表面其它生物（主要是细菌和真菌）的过程。 1.外植体表面消毒的必要性：植物材料表面都带有细菌和真菌，如消毒不彻底，细菌和真菌会在培养基中迅速生长，占据空间、消耗营养、分泌毒素，使植物材料死亡。因此，接种前对外植体进行有效的表面消毒是建立无菌培养的关键。 2.表面消毒的要求： （1）最大限度地杀死细菌和真菌 （2）对外植体的毒害要尽可能的小 3.常用消毒剂： 消毒剂 消毒浓度 消毒时间 效果 优缺点 乙醇 70%-75% 10S-5 min，多1min内 较差 易清洗，但对材料伤害大。 氯化汞 0.1% -0.2% 5-30 min 很好 毒性大，难清洗，清洗不够则对材料有残毒效应。 次氯酸钠 1% 有效氯 5-30 min 较好 易清洗，对材料的残毒效应小。 双氧水 3% 10-60 min 一般 易清洗，对材料的残毒效应小。 4.外植体的表面消毒消毒步骤： ①用自来水将材料冲洗干净。 ②将材料上的水擦干，并剪成适当大小（长短）的小块（段）。 ③在70%-75%的乙醇中10-60 S，然后迅速转入到其它消毒剂（氯化汞、次氯酸钠）中，消毒剂中可加入少量表面活性剂（Tween 20或80、家用洗涤剂等），以增加消毒效果。 ④消毒结束后，将材料转入无菌水中漂洗2-8次； ⑤将材料的伤口部分切去后，再将其切成适当大小，及时接入到培养基中。 5.材料内部污染的控制。表面消毒不能杀死内部的细菌，可尝试下列方法： ①用分生组织作为外植体； ②在培养基中加抗菌素（青霉素、卡那霉素、四环素等）； ③尽量将材料切小，并且每接一个外植体就将接种工具消毒一次，避免交叉感染。 第五章   高等植物离体再生和无性繁殖 有性繁殖（Sexual propagation）:通过两性细胞结合形成的种子进行繁衍后代的方法叫有性繁殖。因为繁殖体是种子，所以又称种子繁殖。 无性繁殖（Asexual propagation）:通过植物体一部分（常是营养器官，如芽、根、茎、叶等）繁殖的方法，所以又称营养繁殖（vegetative propagation）。植物的无性繁殖有分株、扦插、压条和嫁接4种方法。 植物离体再生(in vitro plantlet regeneration)：在离体条件下，植物外植体（根、茎、叶、花等）形成完整植株。 不定芽(adventitious bud): 从外植体不固定的位置形成的芽。 体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis)：指诱导植物体细胞形成体细胞胚（胚状体）的过程。 1.无性繁殖的优缺点： 优点：所繁殖的植株与母株的性状一致； 缺点：繁殖速度有限，特别是当起始材料少时，不能快速推广优良植株；容易传播病害。 2.植物离体再生的途径：顶芽与侧芽再生途径；不定芽再生途径；胚状体再生途径；拟原球茎再生途径。 3.植物离体无性繁殖的过程： ① 繁殖体的诱导（芽、胚性愈伤组织、Plb） ②繁殖体的增殖； ③植株再生（芽的生根、胚状体形成与萌发、 Plb分化植株） ④小苗移栽: 将再生植株由组培室移栽到温室、田间。 4.顶芽与侧芽再生途径步骤： ① 选择适当的枝条、茎段，消毒； ②茎段培养（nodal culture）或茎尖培养（shoot tip culture)；1-2芽/段 ③促进顶芽和侧芽生长，形成幼茎(shoot); ④幼茎生根、形成完整植株。 （重复2和3，可以大量繁殖植物） 5.顶芽和侧芽再生途径的特点： 优点：顶芽和侧芽是植物生长发育过程中自然形成的，发生变异的比率很低。利用顶芽和侧芽途径繁殖植物时变异率最小，所繁殖出来的群体在性状上能最大限度地与母株保持一致。 缺点：速度可能比较低，不能满足要求。 6.顶芽和侧芽再生途径可能存在的问题： ①不是所有的植物都可以进行茎段培养。只有茎能伸长的植物（菊花、马铃薯、葡萄、木本植物等）才可用法，节间短、莲座状的植物（如凤梨、非洲菊、白菜等）则不能用。 ②繁殖效率比较低。（繁殖速率：侧芽生长率、生长速度和长度(节数)） ③侧芽萌动率高，但伸长不好，影响增殖效率和生根。 7.不定芽再生途径过程： ①外植体的选择与消毒； ②不定芽的诱导（外植体既可以直接形成不定芽，也可以先形成愈伤组织，再由愈伤组织形成形成不定芽）； ③芽的增殖(茎段培养或不定芽)； ④不定芽的生根。 8.影响不定芽形成的因素： ①植物种类和品种（基因）差异： 植物外植体形成不定芽的能力：草本植物大于木本植物；双子叶植物大于单子叶植物。 即使同一种植物，品种之间往往也有很大的差异。 ②外植体的类型：同一株植物以不同的器官（根、茎、叶、花、果实、胚）作为外植体，其形成不定芽的能力往往会有差异。 ③外植体的生理状态：幼年期的外植体形成不定芽的能力大于成熟期的外植体，特别是木本植物。一株植物不同部位的成熟度与其到根部的距离呈正相关。 9.不定芽途径的优点和缺点 优点：（1）取材料方便，可以不毁坏母株； （2）芽的增殖速度快，繁殖效率高。 （3）是培育转基因植物的重要途径。 缺点：植株变异的几率较大。 10.无根苗生根两种类型：皮部生根型和愈伤组织生根型。 皮部生根型：根直接从无根苗基部茎的皮层处长出。 愈伤组织生根型：无根苗基部先形成愈伤组织，再在愈伤组织上形成根。 11.影响无根苗生根的因素： ①植物的类型和品种：草本比木本易；幼年期外植体形成的无根苗比成年期形成的无根苗容易； ②基本培养基成分：不同培养基的无机盐浓度差异较大，对生根的影响也比较大。一般较低的无机盐有利于生根； ③生长素：有些植物可以在无激素的培养基上生根，但大部分则要求使用一定浓度的生长素。在诱导生根方面，IBA﹥NAA﹥IAA。 12.胚状体途径植株再生的过程： ①选择合适的材料、诱导胚性愈伤组织（能够产生胚状体的愈伤组织） ②促进胚性愈伤组织形成正常的胚状体（球型胚、心型胚、鱼雷型胚、子叶胚、成熟胚） ③促进胚状体萌发成苗 13.影响胚状体诱导的因素： ①植物种类：不同种类植物形成胚状体的能力差异很大。 ②外植体种类 ③外植体生理状态：幼年期外植体高于成年期外植体，尤其是用合子胚及种子萌发的幼苗为外植体，容易诱导成功。 ④植物激素： 少数植物可以在无激素的培养基上形成胚状体，如人参；大多数植物则需要在生长素、或细胞分裂素、或生长素和细胞分裂素共同作用的诱导下才能形成胚状体，