细胞转染的步骤.docx

【试剂与仪器】 1 ．小牛血清。 2 ．双抗溶液（链霉素 100μg+ 青霉素 100 单位）。 3 ． DMEM 培养基。 4 ．转染试剂（ LIPOFECTAMINE 2000 ）。 5 ．细胞培养基（ DMEM+10%NCS ）。 6 ． PBS 。 7 ．无血清培养基。 8 ．胰酶（ Trypsin ）。 9 ．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机， 15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜和 CCD 。 【操作步骤】 1 ．转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为 90% 。细胞铺板在 0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞，使用 50μl 无血清 DMEM 培养基稀释 0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制备。 3. 对于每孔细胞，使用 50μl DMEM 培养基稀释 1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。 LIPOFECTAMINE 2000 稀释后，在 5 分钟内同稀释的 DNA 混合。保温时间过长会降低活性。 4. 混合稀释的 DNA （由第 2 步）和稀释的 LIPOFECTAMINE 2000 （由第 3 步）。在室温保温 20 分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持 6 小时稳定。 5. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为 0.5ml 无血清培养基。 6. 在 37℃ ， 5 ％的 CO 2 中保温 24-48 小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在 4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7. 在细胞中加入复合物 24-72 小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。