细胞杀伤力曲线测定.doc

2012-10-10 DMEM/F12培养基配制 gibco D-MEM/F-12 CAT.NO.12500-062 LOT.NO.1206536 干粉培养基，每包装配1L。 直接溶于1L纯净水中，加2.438g碳酸氢钠，搅拌2小时，pH试纸检测中性。 0.22μm滤器过滤180ml培养基入250ml血清瓶。 5瓶180ml，1瓶不到180ml。 其中1瓶180ml培养基加入FBS 20ml。 2012-10-11 CHO-S细胞复苏： 41℃迅速溶解1min； 2ml细胞液+6ml DMEM/F12 10%FBS加入离心管，轻柔吹散。 离心1000rpm 5min； 弃上清； 加入3ml DMEM/F12 10%FBS，轻柔吹散,加入75ml细胞方瓶，补3ml DMEM/F12 10%FBS； 轻柔混匀，镜下观察，细胞密度85%-90%，细胞呈圆形悬浮； 37℃ CO2培养； 2012-10-12 细胞观察： 贴壁，90%密度； 95%呈圆形，少量有梭型倾向，密度过高，决定传代； 细胞传代：13:00 弃上清； 加入胰酶，2滴管（37℃回温）； 室温显微镜下观察，有微量脱落，1min； 倒出胰酶，加入5ml DMEM/F12 10%FBS，9区吹扫程序3次； 1传2，补2.5ml DMEM/F12 10%FBS； 原瓶中还有未脱落细胞，又加入5ml DMEM/F12 10%FBS继续培养，胶布标记。 2012-10-13 观察细胞状态： 贴壁，有少量呈梭型，大部分为原型，但并不圆润。 2012-10-15 观察细胞： 大部分为梭型，少量为原型，约80%，培养基开始变浅。 细胞传代： 两瓶量多的1传2； 2012-10-16 观察细胞： 传代时分散不好的细胞过夜培养后镜下观察，成团状生长，有展开细胞。 换培养液：13:00 未脱落细胞换液，生长良好。 配PBS: NaCL 1.6g, KCL 0.04g, KH2PO4 0.04g, Na2HPO4.12H2O 0.726g, H2O 200ml, 高压灭菌。 2012-10-17 胰酶消化分散传代： PBS清洗2遍； 胰酶侵润，立即倾倒或保持； 显微镜下观察1min； 加入5ml培养基； 吹扫分散，1传2； 2012-10-18 细胞观察： 尹骏传代的4瓶有2瓶没贴壁，我怀疑是第一次做的时候胰酶消化的时间过长，损伤了细胞壁；（需要严格控制消化时间，尤其注意，胰酶在倒出后，应立即加入终止培养基。） 我传代的6瓶贴壁生长正常，但还是有团块生长；（这种团块生长可能是第一次传代为吹匀所致，并不是第二次传代可以吹散的，计划降低接种比例，延长生长时间，逐步减少团块数量。） 2012-10-19 配制胰酶： life science进口分装胰酶； 0.25%，100mlPBS溶解； 0.22μm过滤； 冻存液配制： 5%DMSO，250μLDMSO，4750μL含血清培养基。 细胞冻存： 选密度较高，展开细胞较多，团块较少的4瓶细胞消化冻存； 倒掉培养基； 2ml胰酶，室温60秒静置； 倒掉胰酶； 加入5ml培养基，9区吹扫，液面下吹打80次； 1000rpm离心5min； 倒掉上清； 加入冻存液； 立即放入4℃，1h； -20℃，3h； 液氮口过夜； 装入液氮存储核； 6B41\6B42\6B34\6B22 其中有一只冻存管细胞较少，已标明。 细胞传代： 一瓶1传2； 一瓶1:4传代。 （新配的胰酶很好用，细胞容易打散） 2012-10-20 尹骏传代的两瓶贴壁不好的细胞今日换液，去除死细胞 2012-10-21 细胞观察： 1:4传代的一瓶（原瓶）培养基变黄，细胞贴壁展开非常好，比其他几瓶都好，未见染菌。推测细胞展开良好，没有接触抑制，代谢旺盛，生长迅速。建议立即换液。 细胞换液： 1:4传代的一瓶（原瓶） 2012-10-22 细胞观察： 前日培养基颜色变化很大的一瓶细胞，换液过夜后颜色变化依然很大，并且细胞形态由展开向收缩发展，决定放弃。 细胞传代： 取三瓶细胞形态较好的1:4传代；共传6瓶，计划4瓶冻存，2瓶用于DNA提取； 使用吸管吹散，细胞分离不完全，见2-8个聚集。 培养基配制： 从马格非分装血清中分出80ml，其中20ml加入180ml培养基中待用，60ml储存。 细胞复苏： 尹骏复苏了2012-10-19冻存的细胞一只。 2012-10-24 细胞观察： 22日1:4传代细胞有聚集有展开，不是最佳状态，可能不适于冻存，原因可能是上次用吸管吹的力度比较小，为完全吹散； 按照罗成的建议可以适当这延长消化时间，尽量减少吹打的损伤； 胰酶消化和枪吹散哪种更损伤细胞？ 2012-10-25 细胞冻存： 冻存4只细胞（有一只打破了还剩3只） 冻存液配制： 10%DMSO，400μLDMSO，3600μL含血清（10%）培养基。 细胞冻存： 倒掉培养基； PBS漂洗2遍； 2ml胰酶，室温70秒静置； 倒掉胰酶； 加入5ml培养基，9区吹扫，液面下吹打80次； 1000rpm离心5min，弃上清； 加入1ml冻存液，迅速混匀； 4℃1h，-20℃2h，液氮口过夜（绳子太长了接触到液氮了），放入液氮存储盒里，6B34/6B22/6C23。 胰酶消化一瓶细胞，离心收集，用于全DNA提取。 2012-10-25 CHO-S全DNA提取： 2012-10-26 细胞传代： 3ml吹扫，0.3:4.7接种； 1ml枪弹簧很松，吹打了110下，细胞基本分散； 传代4瓶。 2012-10-27 细胞复苏：19:00 2012-10-25冻存细胞（10%DMSO）； 离心管加入4ml培养基； 细胞瓶加入2ml培养基： 取出冻存细胞，42℃水浴，快速震荡，至融化。 加入到含4ml培养基离心管； 离心1000rpm，1min； 弃上清； 加入5ml培养基，短暂吹打，重悬； 加入含2ml培养基细胞瓶，7ml过夜培养（加大对DMSO的稀释比例）。 2012-10-28 细胞观察：9:00 27日复苏细胞有30%贴壁，呈圆形，未展开，分布均匀； 26日传代细胞贴壁，50%展开，有少量悬浮，计划29日换液。 细胞换液： 对27日复苏细胞进行换液，为进一步降低DMSO影响。 2012-10-28 引物稀释： 8Lout加H2O 521μl稀释为10μM，分装3管10μl； 8Rout加H2O 636μl稀释为10μM，分装3管10μl。 2012-10-29 26日传代细胞观察： 26日传代细胞状态良好，展开率高。 27日复苏细胞观察： 27日复苏细胞基本没有分裂，形态介于展开间，形态异常 2012-10-29 Prime STAR PCR： buffer 10μl dNTP Mix 4μl CHO-S DNA(10/25) 1μl 8Lout 1μl 8Rout 1μl Prime STAR 1μl H2O 32μl 1：95℃ 5min 2-30：94℃ 30s 52℃ 30s 72℃ 30s 31：72℃ 5min 2012-10-30 26日传代细胞冻存：3只 5B52/6B22/6C23 传代4瓶：0.5:4.5 2012-10-30 2012-10-31 30日传代细胞观察： 有一瓶明显展开率偏低，还观察到一个异常的大细胞，内部有几个膨胀囊泡， 用白胶布做标记。 27日复苏细胞观察： 随生长缓慢，但以开始展开，未见悬浮死亡。 2012-10-31 电泳： 在500左右位置可见一相对高亮条带，但比较模糊，无法提取。见弥散性杂带，提高退火温度可以缓解。可条带貌似比500小，理论应该比500大。 2012-11-1 30日冻存细胞复苏： 30日传代细胞观察： 异常的那瓶细胞出现死亡现象，漂浮细胞明显增多； 计划下午三点对其余三瓶细胞换液。 27日复苏细胞观察： 细胞形态趋于正常。 2012-11-1 2012-11-2 2012-11-2 2012-11-3 30日传代细胞再传代： 8瓶，1传4比例，用于冻存，建立野生型细胞库。 2012-11-3 CHO-DNA提取： 1瓶细胞提2管，双倍的GB，70℃共40分钟，少量不溶胶状物用枪挑出，电泳可见条带。 Prime STAR PCR： buffer 10μl dNTP Mix 4μl CHO-S DNA(11/3) 1μl 8Lout 1μl 8Rout 1μl Prime STAR 1μl H2O 32μl 1：95℃ 5min 2-30：94℃ 30s 58℃ 30s 72℃ 30s 31：72℃ 5min 10/31的PCR显示特异性和效率不高，退火温度为52℃，本次11/4提高了退火温度到58℃，为见PCR条带，怀疑退火温度提高太大，引物Tm值为61到63℃，理论退火温度56℃。为了兼顾效率和特异性计划使用touchdown PCR。 2012-11-4 touchdown PCR 1: 95℃ 30s 2-14: 94℃ 30s 58℃-52℃ 30s 72℃ 30s 14-32: 94℃ 30s 52℃ 30s 72℃ 30s 33: 72℃ 5min Prime STAR PCR： buffer 10μl dNTP Mix 4μl CHO-S DNA 1μl 8Lout 1μl 8Rout 1μl Prime STAR 1μl H2O 32μl 电泳未显示条带，发现有人将第二次基因组提取时用的乙醇换成了TIRS，正是第二次提取的DNA两次PCR都没有条带。 2012-11-5 10/30冻存11/1复苏转瓶： 消化，分散，全转新瓶。 2012-11-5 用第一次提取的DNA进行PCR，Prime STAR和Taq两组，touchdown PCR条件。 Prime STAR PCR： buffer 10μl dNTP Mix 4μl CHO-S DNA 1μl 8Lout 1μl 8Rout 1μl Prime STAR 1μl H2O 32μl Taq PCR： Buffer 5μl MgCl2 5μl dNTP 8μl 8Lout 1μl 8Rout 1μl CHO-S DNA 1μl Taq 1μl H2O 28μl 1: 95℃ 30s 2-14: 94℃ 30s 58℃-52℃ 30s 72℃ 30s 14-32: 94℃ 30s 52℃ 30s 72℃ 30s 33: 72℃ 5min 目的条带亮度很低，与普通PCR条件相比目的条带附近杂带较少，而大分子量杂带较多。按照位置推算正确。做基因提取应该可以。考虑染色体结构庞大复杂，建议延长变性时间。 条带回收： 第二轮Prime STAR PCR： 1：95℃ 5min 2-30：94℃ 30s 52℃ 30s 72℃ 30s 31：72℃ 5min 2012-11-6 11/3传代细胞冻存： 7只，有一瓶培养