细胞的裂解.doc

组织培养细胞的裂解       对于组织培养中生长的细胞，最有效的裂解方法是用去污剂进行处理。虽然有多种去污剂可用于裂解细胞，但最常用的是TritonX—100或NP—40等非离子型去污剂。非离子型去污剂能溶解胞质和细胞膜，破坏分子间许多微弱的结合键，并能溶解大部分经常研究的蛋白质抗原，但对于大分子多聚抗原则无效，在大多数情况下该抗原也是难以研究的。浓度介于0．1％～1％的去污剂即可满足几乎所有溶解需求。非离子型去污剂裂解液一般补充等离子浓度的盐和接近中性的pH。       在某些情况下，需要较剧烈的抽提条件以释出所研究的抗原或除去微弱的相关蛋白。此时，推荐使用RIPA裂解缓冲液，该体系含离子型和非离子型去污剂，具有相当大的变性能力。除细胞内不溶性蛋白外所有可溶性蛋白分子均可释出，并能破坏大部分非共价的相互作用。       除非有特殊原因，推荐在裂解缓冲体系中加入蛋白酶抑制剂混合液。在新抗原研究的早期使用蛋白酶抑制剂总是有利的。在该蛋白已被定性后，可以进行实验以了解这些抑制剂是否在所有情况下都必需。如前所述，终止蛋白酶作用的最好方法是在免疫沉淀的全部过程中溶液保持低温。       如果研究经磷酸化修饰的蛋白质时，应考虑加入磷酸酶抑制剂。     1．准备工作     由于免疫沉淀有多个步骤，且包括数小时孵育，因此在实验开始前必须安排好时间，注意适当利用过夜孵育的时间间隔。这将有助于决定何时开始裂解细胞。     2．所需溶液     PBS，裂解缓冲液(4℃预冷)。     3．操作步骤     (1)单层细胞的培养，用室温PBS洗细胞一次，然后甩干；悬浮培养的细胞，400g离心10min，收集细胞弃上清液。    (2)对于单层细胞培养，将培养瓶置于冰上，每lOOmm培养瓶加入1 mL溶解缓冲液(4℃预冷)；对于悬浮培养，将盛细胞团的试管置于冰上。按107个细胞加入1．0ml裂解液(4℃预冷)。     保存在冰箱的裂解液可随时使用。     (3)冰上放置3min，不时敲击贴壁细胞培养瓶，或轻摇悬浮培养细胞。     (4)对于单层细胞培养，敲击培养瓶数次，混合均匀，在冰床上倾斜培养瓶使溶液集中于一侧，然后将裂解物移置另一支1．5mL圆锥形试管。有些研究者喜欢从瓶壁刮取细胞，但除特殊要求外此举并非必须。     (5)单层培养的细胞或悬浮培养的细胞均以10 000g，413离心10min，仔细吸取上清液盛于另一试管，不可搅动细胞团。置冰上。 此时，上清液可用于下一步的预处理。       4．常见问题        上述程序最普遍的问题是抗原不完全从细胞内释放。可以通过对裂解液和细胞残渣进行免疫印迹来检查抗原是否完全释放。改变裂解液所用的去污剂是增加抗原释放的最有效方法。     机械性剪切也可破坏细胞膜，常见的方法包括使用超声波发生器、Dounce匀浆器、波特器和搅拌器等。这些方法特别适用于大体积制备或需避免使用去污剂时。在这些方法中，最温和的方法是使用Dounce匀浆器，但仅适合于较大体积的标本(数毫升或更多)。     一般不推荐冻融法，因反复冻融会使蛋白质过量降解，其原因不明。除非所研究的抗原特别能耐受蛋白水解作用或者事先已测试过该方法，一般不作为首选。通常，用去污剂裂解是免疫沉淀的最好方法。