第一种方法蛋白匀浆缓冲液：50mMTris-HCl(pH7.5)150mMNaCl5mMEDTA1%NP-401mMPMSF操作步骤直接用这个进行组织匀浆然后于10000rpm离心20分钟收集上清作SDS－PAGE电泳从染色的情况来看所得到的总蛋白纯度都不错条带比较清晰。我是作的小鼠八种常规组织也包括肾脏在内。将抽提好的蛋白分装后直接放在负八十保存。上样大概3~8ul每孔都可以的具体看个人需要。70v浓缩，150v分离第二种方法裂解液配方：尿素：8MCHAPS:4%DTT:65mM(现加）PMSF:1mM(现加）MiliQ水操作步骤：取300mg样品在液氮环境下研磨，加入1ml裂解液混匀，室温静置1小时（实验证明改为匀浆更好，蛋白降解轻），15000g离心1小时，取上清测定蛋白质浓度。在裂解液中加IPGbuffer有两个作用:1,增强蛋白质的溶解性2,可以结合核酸,在沉淀的时候予以除去。建议最好加，浓度从0.5-2%不等（这取决于您样品蛋白质的难溶程度）。IPGbuffer是载体两性电解质，IPGbuffer另外一个作用是促进蛋白质溶解的,所以IEF前一定要加，裂解液中没有IPGbuffer可以么？（可以的，最后上胶条的时候可以再加）不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离心一下，把一些结缔组织给离心掉（150g既可）然后再加裂解液。裂解液加1ML应该没什么问题，主要取决你以后蛋白的浓度。用这个方法最好经丙酮沉淀一次比较好）第三种方法建议最好加完裂解液后再用超声波破碎，我做肝脏蛋白提取时一般采取400W工作10秒，间歇10秒，次数15次，一次结束后大约30分钟再重复上述步骤一次（因为不同的样品用一根超声柱子，可能会导致污染，所以一定要用双蒸水冲洗干净，再用70%乙醇洗一下，再用水洗一次），另外样品超声时要置于冰浴中，以免产热做过的是用10ml蛋白裂解液来匀浆3克的组织，最终用考马斯亮兰染色法测得的蛋白浓度大概为30~50ug/ul测595OD值时，设定一个只用水的空白，把所有测得的值都减去这个空白。再用减后的值做标准曲线。查得未知蛋白浓度时，也要用减后的值在标准曲线上查得。培养细胞细胞培养于100mL/LFCS+RPMI1640培养基中，待生长至对数生长期密度约为80%时用细胞括括下细胞离心收集．按细胞/裂解液体积比1:10加入细胞裂解液(7mol/L尿素，2mol/L硫脲，40g/LCHAPS，65mmol/LDTT)，同时加入1mmol/L苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsufosyl，PMSF)，旋涡振荡，反复液氮快速冻融4次，加DnaseⅠ50mg/L和RnaseA25mg/L室温作用15min，4°C15000g离心1h，收集上清液-80°C冻存备用，Bradford法测定蛋白浓度[17]．第四种方法哺乳动物组织...
