细胞的复苏-简单步骤v.doc

一． 实验名称：细胞的复苏 二． 实验目的：将冻存的细胞恢复活性 三． 实验原理：在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-700C的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。而复苏就是将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 四． 实验步骤 一. 实验前准备： 1.将水浴锅预热至37℃，将培养液预热后分装到培养皿中 2.离心管、吸管、培养瓶等等。 二．取出冻存管： 1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。 2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。  三．迅速解冻： 1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。 2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。 四.平衡离心：用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min 五.制备细胞悬液： 1.吸弃上清液。 2.向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。 六.细胞计数： 细胞浓度以5×105/ml为宜。 七.培养细胞： 将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。 初学者易犯错误： 1水浴锅未预热或者未预热到37℃。 2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。 3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。 4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。 版本2 一、细胞复苏的原则 在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。 二、细胞复苏的主要操作步骤 （1）佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。 （2）迅速放入 38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。 （3）在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。 三、注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-5～0℃）。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上（已死亡）的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。 1.DMSO是细胞内防护液。DMSO能快速通过细胞膜进入细胞内部，在细胞冷冻过程中，维持细胞内外的水和离子平衡。将DMSO与右旋糖苷等细胞外防护液组合使用效果更佳。 2.在常温下，DMSO是有细胞毒性的。因此在往细胞悬液中加DMSO时，要在冰水混合物中进行，一方面避免加入DMSO时放热，对细胞造成损伤；另一方面避免温度较高时，对细胞的毒性。 3.细胞冷冻时，DMSO的浓度一般控制在5～15%,不能再高，否则也对细胞有毒性。一般用冷冻管冻细胞时，体积一般再1～1.5ml，当把这些溶液加到20ml的培养液中时，此时DMSO的浓度只有0.25～1％，浓度已经很低，对细胞的毒性不大，培养转替换液最佳。