基因芯片技术在检测肠道致病菌方面的应用生物技术专业.doc

基因芯片技术在检测肠道致病菌方面的应用 摘要：当前，基因芯片技术被广泛的应用于各种研究领域，如基因突变及多态性分析、细菌基因鉴定、致病分子机理、表达谱分析、DNA测序等多个方面。文中通过毒力因子的检测、通用引物结合基因芯片来检测肠道致病菌。随着基因芯片技术的发展，也会伴随着各种问题的产生，只有不断地发现问题，解决问题，改进基因芯片检测技术，才能不断的完善基因芯片检测技术。随着检测的目的的致病菌的种类的不断的增加、基因芯片技术检测方法不断创新，使得基因芯片检测技术不断的成熟和完善。 关键词：基因芯片 肠道致病菌 检测 Gene chip technology in the detection of intestinal pathogenic bacteria ABSTRACT ：At present, the gene chip technology is widely applied in various research fields, such as gene mutation and polymorphism analysis, identification, pathogenic molecular mechanism of bacterial genes, expression profile analysis, DNA sequencing, and other aspects.By detecting the virulence factors, general primer combination of gene chip to detect the intestinal pathogenic bacteria.With the development of gene chip technology, will be accompanied by the production of all kinds of problems, only by constantly to find problems, solve the problem, improve gene chip detection technology, to constantly improve the gene chip detection technology.With type of detection of pathogenic bacteria of the purpose of continuously increase, gene chip technology to detect method, continuous innovation, making gene chip detection technology continues to mature and perfect. Keywords: Gene chip； Intestinal pathogens； Detection 当前在食物生产全球化的大背景下，由于人们饮食习惯的改变以及世界的环境卫生状况越来越差，食品的安全性降低，引发了全世界人们的关注。由于食品安全性的降低，诱发了肠道致病菌的感染。因此，随着人们关注食品安全程度的越来越高，自然的关注到了肠道致病菌的感染。当前，世界上有很多的国家都非常注重这个问题，并采取了相应的措施。当前，切断导致病菌的传染途径，改善人们的生活条件和饮食条件已经成了刻不容缓的问题。本文所论述的正是基因芯片检测技术在肠道致病菌检测方面的应用。 一、基因芯片技术简介 20世纪80年代，基因芯片技术诞生。它利用了生物化学、分子生物学等多个学科的现代技术，实现了样品监测分析过程中的连续化、集成化和微型化。Ye等学者详细的介绍了基因芯片技术在微生物方面的应用。基因芯片是指反向斑点杂交，特异探针以一定得方式固定在某种介质上，扫描时以点出现，每一个点代表一种特异性探针序列。这种技术可以检测多种片段，比如：基因组DNA、总RNA 、a RNA、质粒RNA等等。标记的方法一般是利用荧光基因通过特定波长进行扫描检测。 二、基因芯片技术检测肠道致病菌 基因芯片技术不但提高了检测的水平，而且能够同时对多种致病菌进行鉴定，这是传统的检测方法如分子生物学、免疫学技术所不能比拟的。不仅缩短了检测的周期，而且结果自动化分析，避免了由于操作人员的错误而导致错误的结果，是食品安全检测方面的重大技术突破。 2.1 检测肠道致病菌的毒力因子 当前科研人员选取各种致病菌特异性的毒力因子作为检测的靶标。通过多重PCR的方法扩增多种致病菌，同时标记PCR产物，然后经过基因芯片杂交进行鉴定。Chizhikow 等学者以多重PCR扩增与食源性致病菌相关的6种毒力因子为基础建立了一种基因芯片检测系统，和芯片杂交的方式鉴定了6种基因。目前这种技术路线应用于少数肠道致病菌鉴定方面，效果良好。本实验已经建立了一种用于甄别霍乱弧菌O139的基因芯片和出血性大肠杆菌O157：H7，通过检测毒力基因以及SNP s位点，将霍乱弧菌O139和O1以及出血性大肠杆菌O157：H7和非H7。从实验结果不难看出，通过多重PCR扩增，将致病菌的毒力因子作为检测目标的靶细菌，以杂交筛选的方式和基因芯片相结合是完全可行的。充分体现了基因芯片检测技术的的灵敏度高、特异性、等特点。弥补了多重PCR不能鉴定多种目的的片段的弊端。但是这种技术仍然受制于多重PCR，检测的数量少。但是对于细菌分型等方面，非常适用。 2.2 通过引物结合基因芯片检测肠道致病菌 2.2.1 通用引物扩增16S rDNA基因、23SrDNA基因 该2种基因具有非常重要的生物学意义，在生物进化过程中比其他的基因演变的慢，被称为“细菌进化的活化石”。然而保守性是相对的，序列中仍然存在着特异性的片段，且不同菌属差异性很大。因此，在细菌的保守性区域，设计通用引物，一次就可扩增出多种细菌的目的片段。然后采用标记法、渗入法以及末端标记法等，设计相对应的特异性探针，通过基因芯片与PCR产物杂交的结果对细菌进行鉴定。有的实验室的基因芯片研究小组对致病菌的16S rDNA和23S rNDA基因进行检测，建立了一种基于二重PCR方法的基因芯片检测方法，可同时检测15种肠道致病菌，检测的灵敏度达到103 CFU/mL。 于选取的目的基因保守性相对较强，有些致病菌只能鉴定到细菌属的水平，无法鉴定到细菌种的水平。但是与毒力基因检测方法相比较，达到高通量检测的水平，突破了检测数量的限制，操作简单，成本较低，适用于食品安全体系的监控等多个方面。 2.2.2 基因芯片直接检测致病菌的16S rRNA基因 因为在一些较为复杂的介质中如土壤、粪便等，一些PCR反映抑制物存在，使得细菌核酸进行PCR跨增是非常困难的。解决方法之一是直接检测致病菌的rRNA。 原理：将16S rRNA序列上不同种属的特异性片段作为探针（1000 bp 左右），反转录标记后，直接检测rRNA 可显示介质中致病菌的死活状态。方法弊端，灵敏度较低。 Guschin等学者开建立一种基于聚丙烯酰胺凝胶垫的基因芯片检测系统，也适用于检测16S rRNA。尽管直接检测16S rRNA基因，能够检测致病菌的死活状态，特异性很好，但是这种检测的实验条件和操作者的水平要求较高，灵敏度较低。并且该方法还受到致病菌所处的生长状态和介质形态等因素的影响。因此很难再实际的检测中推广。 2.2.3 基因芯片直接检测致病菌的DNA 直接检测DNA同样可以解决复杂样品中存在酶抑制物的问题。其原理与直接检测rRNA相似。由于DNA本身更加的稳定，易操作而且在细菌体内的含量较高，所以直接检测DNA的方法不能确定致病菌的死活状态，但却能够更好的鉴定肠道致病菌。 Sekowshi 等学者通过基因芯片与基因组DNA杂交的方法，从而区分肠出血性大肠杆菌O157:H7和非致病性大肠杆菌，该方法的灵敏度要高于免疫学的方法。 当样品中含有较低浓度的致病菌时，直接检测样品中分离出的DNA相当的困难。并且不同的菌属之间存在许多的同源序列，不可避免的就存在很多同源性序列交叉现象，而且对探针的设计要求很高。对结果影响较大。因此与结合PCR扩增的基因芯片方法相比，这种方法限于实验室的基础研究。 三、基因芯片用于细菌分型 基因芯片检测致病菌技术还可以应用到微生物的基础研究过程中，通过对致病菌基因组DNA、rRNA进行遗传分析，从而计算出细菌种属间的遗传距离以及判断分析菌体的毒性等。Borucki等学者建立了一种鉴定不同血清型的单增李氏菌的基因组芯片，从而清晰的将24种单增李氏菌区分为俩种类型。该基因组分型芯片的结果正确与否要同足迹法技术比较，该实验结果与足迹法技术一致，结果正确。本实验室建立了炭疽杆菌基因组芯片，通过与其他芽孢杆菌组杂交，鉴定出炭疽杆菌特异性基因。这种方法适用于高通量的筛选出多种差异基因，还可以对更大规模的基因进行筛选，可以应用到细菌致病分子机理等基础研究中。 四、基因芯片在肠道致病菌检测方面存在的问题及解决途径 4.1 基因芯片在肠道致病菌检测方面存在的问题 基因芯片技术虽然弥补了传统检测方法的很多不足之处，比如不能同时检测大规模样品、检测方法繁琐缓慢，结果不够准确。但是由于基因芯片技术发展时间较短，所以本身仍然存在很多的不足之处。 1. 当前由于存在很多的基因制备方法，导致各个实验室的基因芯片的性能无法比较，而且基因芯片缺乏稳定性。 2. 虽然荧光基因标记技术成熟，但是荧光染料非常昂贵，并不适合大规模和常规的使用。 3. 基因芯片技术不如PCR等技术灵敏度高，在少量致病菌感染的情况下可能会出现阴性结果。 4. 新发的各种肠道致病菌不断的出现和变异。 4.2 基因芯片在肠道致病菌检测方面存在的问题的解决的方法 1. 本实验室基因芯片小组在将可视化技术结合到基因芯片技术检测中，取得了一定得成果。该技术能够使得肉眼判断芯片杂交结果，可降低实验成本，简化操作流程。 2. 基因芯片的灵敏度可通过改善核酸提取技术改善。研究高效的提取方法。 3. 针对肠道致病菌的不断出现和变异可通过增加基因芯片检测中靶细胞来改善。 综上，可以知道虽然基因芯片检测技术存在很多的问题，但是也取得一定得成果， 五、基因芯片在肠道致病菌检测方面的前景 本文所论述的基因芯片技术应用于肠道致病菌中的检测，不仅提高了检测的能力，而且实现了同时对大规模样品的检测，成为一次具有革命意义的技术突破。当前在国际上，基因芯片技术已经得到广大的科研工作者的认同，成为了当前分子诊断和遗传分析重要的技术平台。随着检测目的致病菌的种类不断的增加、基因芯片技术检测方法不断创新，使得基因芯片检测技术不断的成熟和完善。将来应用于肠道致病菌的基因检测技术将会得到大规模的应用，呈现出更广阔的应用前景。 参考文献 [1] Ye R,Wang T,Bedkey L ,et al.Applications of DNA microanalysis in microbial systems .J Micro biol Methods,2001,47:257-272 [2] Chinovnik V,Parasol A,Chumash K,et al.Micro-array analysis of microbial virulence factors,App l Environ Micro-biol,2001,67:3258-3263. [3] Gus-chin DY,Mobarry BK,Proudnikov D,et al.Oligonucleotide microchips as genosensors for determinative and environmental studies in microbiology.App l Environ Micro-biol,199