细胞核荧光染料.docx

细胞核常用荧光染料有： 吖啶橙（Acridine Orange，AO）、溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB）和碘化丙啶（Propidium Iodide，PI），DAPI、Hoechst染料、EthD III、7-AAD、RedDot1、2 等等。 透膜的染料如下： AO：具有膜通透性，能透过细胞膜，将核DNA和RNA分别染成绿色和红色，因此使细胞核呈绿色或黄绿色荧光。 EB：一种高度灵敏的荧光染色剂，在标准302nm处激发出橙红色信号。 DAPI：蓝色一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，其与DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，而与单链DNA结合无荧光的增强。DAPI对双链DNA的染色灵敏度要高于EB和PI，荧光强度比Hoechst低，但光稳定性高于Hoechst。 Hoechst染料：蓝色一类在显微观察中标记DNA的荧光染料，最常见的两种是Hoechst33342和Hoechst33258。这两种染料都在紫外350nm处被激发，在461nm处最大发射光附近发射青/蓝色荧光。与DAPI相比，Hoechst33342加有乙基，具有更强的亲脂性，因此能更好的透过完整的细胞膜，并且细胞毒性更小。 RedDot 1染料： 红色，超强的细胞核选择性，其光谱相似于Draq?5 和 Draq?7。RedDot?染料可被几种常见的激光激发并可在远红外区激发荧光。RedDot? 的红色近红外荧光有效的与其他常用荧光探针区分开来。 不透膜的染料，如下： PI：不同通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI作为红色荧光复染剂首选，PI经常与Calcein-AM或者FDA等荧光探针合用，区分死/活细胞。 EthD III、7-AAD、RedDot 2： 不能透过细胞膜，但能将坏死细胞区分开来；更适合凋亡坏死实验的检测； 细胞核荧光染料（PI DAPI Hoechst33342） 细胞核荧光染料PI碘化丙啶（简称PI）是一种常用的细胞核荧光染色剂。它不能透过完整的细胞膜，但PI能透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的膜而将细胞核染红，PI在绿色光（540nm波长）的激发下，会在600nm（红色光）处发出明亮的荧光，与细胞核中的DNA结合的PI发出的荧光，与未结合的PI相比，强度会增强20-30倍。40016Propidium iodide(PI)100mg40017Propidium iodide, 1.0mg/1mL solution in water10mL 碘化丙啶 英文名：　Propidium iodide, Propidium diiodide; PI 分子式：C27H34I2N4 分子量：668.39 外观：红棕SF末 应用：DNA染色 染色原理： 碘化丙啶(PI)是一种溴化乙啶的类似物，它在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用 来与Calcein-AM或者FDA等荧光化合物一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。 光谱性质：PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和 615nm。 染色过程： 1． 用PBS或适当的缓冲液制备10～50μM的PI溶液。a) 2． 将1/10培养基体积的PI溶液加入到细胞培养基中。b) 3． 在37℃培养细胞10-20分钟。 4． 用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。 5． 用535nm激发波长，615nm发射波长的滤光器的荧光显微镜观察细胞。 a) 由于PI可能具有致癌性，请小心操作。 b) 也可以用1/10浓度的PI缓冲液代替培养基。 保存条件：4℃避光保存 对人体有刺激性，请注意适当防护 DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)﹐是一种能够与DNA中大部分A，T碱基相互结合的荧光染料﹐常用与荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜﹐它可以用于活细胞和固定细胞的染色。在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。当DAPI与双股DNA结合时，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可以和RNA结合，但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果，其发散光的波长范围约在400nm左右。DAPI的发散光为蓝色，且DAPI和绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)或Texas Red染剂(红色荧光染剂)的发散波长，仅有少部分重叠，研究员可以善用这项特性在单一的样品上进行多重荧光染色。DAPI能快速进入活细胞中与DNA结合，因此DAPI对生物体而言，也被视为一种毒性物质与致癌物。使用过程中应注意操作与抛弃的处理程序。DAPI 为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) ，且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。 Hoechest 33258 是膜透性的,因此在活细胞时候能轻松进入;DAPI是半透性的,有选择性的进入. 因此Hoechest 33258 一般用来染活细胞,可以长驱直入;DAPI一般是染固定细胞. 2、两者都可以用紫外看，参见以下的激发发射波长 Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。 DAPI的最大激发波长为340nm，最大发射波长为488nm；DAPI和双链DNA结合后，最大激发波长为364nm，最大发射波长为454nm。 Hoechst 33342/PI双染色法 1．悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml；帖壁生长的细胞用含有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用1ml全培养液重悬细胞，加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml，37℃孵育7～10min。 2．4℃ 500～1000r/min离心弃去染液。 3．加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。    碘化丙啶染色       1．原理  碘化丙啶(propidium iodide，PI)不能穿人完整的活细胞膜中，即正常细胞和凋亡细胞在不固定的情况下对PI拒染，而坏死细胞由于失去膜的完整性，PI可进入细胞内与DNA结合，根据此特点，使用PI染色可鉴别死细胞。如果对活细胞染色必须在染色前进行固定，以增加细胞膜对染料的通透性。       2．溶液配制  使用0．01mol／LPBS(pH 7．4)配制终浓度为0．5mg／ml的PI工作液。       3．染色程序     (1)单层细胞培养标本经预冷70％乙醇固定1小时，4℃；     (2)0．01mol／LPBS(pH 7．4)冲洗；     (3)沥干后加入PI工作液，室温孵育15分钟；     (4)冲洗后封片。       结果：PI最大激发波长和最大发射波长分别为488nm和630nm，荧光显微镜观察，DNA呈红色荧光。