细胞免疫组化(SABC法).docx

细胞免疫组化（SABC法）步步看： 细胞冻存够了，且状态良好！咋们就开始做细胞免疫组化吧！开始做实验了，先看要准备些什么吧！   实验准备：   实验用品：     移液枪：1ml、200ul、10ul     枪头：1ml、200ul、10ul     枪头盒：1ml、200ul、10ul     EP管：1.5ml     湿盒     需要灭菌的东西：培养皿（可以是重复用的）、细胞爬片（多聚赖氨酸处理，并经过环氧乙烷消毒）、常规细胞培养物品。     试剂：     细胞消化液、完全培养基、4%多聚赖氨酸、0.01M PBS（ph7.2-7.4）、3%H2O2（现配）、0.5%Txiton X-100、浓缩型SABC试剂盒（血清封闭液、二抗、三抗《SABC》）、苏木素、ddH2O、DAB显色试剂盒     操作步骤： 一、细胞爬片的制作   1、细胞用消化液消化后，用完全培养基重悬（4-5ml）或者密度为1-5x106/ml   2、在灭菌的培养皿中铺上3块细胞爬片（圆片），圆片间不要重叠   3、取细胞悬液分别滴到圆片上，注意不要滴到圆片外，让细胞贴片30min左右   4、30min后，在培养皿中补加完全培养液（轻微的加入，以免冲力将贴壁的细胞打下来），放于37°C，5%CO2培养箱中培养3h左右（让其贴壁更牢）。 二、组化前处理   1、取出培养皿，用PBS漂洗2x2min（PBS可以不灭菌）   2、4%多聚甲醛处理（室温）20min；   3、PBS漂洗，3x2min；   4、0.5%Txiton X-100 处理（室温）20min；   5、PBS漂洗，3x2min；   6、3%H2O2处理（室温）15min；   7、PBS漂洗，3x2min； 三、组化   1、血清封闭：试剂盒中的血清封闭液，37°C，20min；   2、取出甩干封闭液（不漂洗）；一抗（1：200）（PBS稀释），阴性对照用PBS代替一抗，37°C1-2h或4°C过夜；   3、PBS漂洗，3x2min；   4、二抗孵育：试剂盒中的生物素化...37°C，20min；   5、PBS漂洗，3x2min；   6、SABC孵育：湿盒内37°C，20min；   7、PBS漂洗，3x4min；   8、DAB显色：DAB试剂盒中的A、B、C三种试剂，我是按照500ul蒸馏水中各加4ul，混匀。在镜下观察显色情况，在没有背景色的条件下可继续显色。一般在2-10min   9、自来水冲洗；   10、苏木素复染，15-30s；   11、自来水冲洗；   12、封片剂封片（有细胞一面对着载玻片），镜下观察 若要长期保存片子，可以对爬片进行脱水处理：     70%（1次，1min）-80%（1次，1min）-95%（1次，1min）-无水乙醇（2x3min）-二甲苯（2x1min），观察是否彻底脱水，看观察片子放入二甲苯时，容器周围有白色雾状产生，若有则说明脱水不彻底。可重新进行！   得到结果：实验组中，细胞浆为棕黄色，细胞和为蓝紫色；阴性细胞中，只有核被染为蓝色，胞浆无色！在此抱歉不能将图片上传，还得用来发文章之用！   在爬片时，圆片不好用镊子夹起，可在圆片之下垫上封口膜，这样操作起来即省事省时，又节约试剂的用量和提高试剂的有效性。 1将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，按2*104/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。 2 PBS清洗标本3次各2 min。 3 4%的多聚甲醛固定15分钟；【冷甲醇：丙酮1：1】 4空气干燥5min。 5 PBS清洗标本3次各2 min。 6 0.5%Triton X-100( DPBS配)孵育1次20 min。 7 PBS清洗标本3次各2 min。 8 3%H2O2孵育15 min。 9 PBS清洗标本3次各2 min。 10封闭血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液）20min。 11一抗孵育（PBS配，滴度1：200，湿盒）4OC过夜 或37OC 60 min。 阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液 12 PBS清洗标本3次各5 min。 13二抗工作液孵育pv6001（湿盒）37OC 30 min。 14 PBS清洗标本5次各2 min。 15、DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约10~15min。 17、蒸馏水或自来水洗1次5 min。（可放六孔板内，再将孔板放在饭盒等内，自来水下冲洗） 18、苏木素复染10min。 19、自来水洗5min。 20、树胶封片。 贴壁细胞需要做免疫组化时，可以在培养皿里放入盖玻片，让细胞长在上面后，在取出来进行实验。需要注意的是：取出培养好细胞的盖玻片后，PBS洗两次后，室温晾干用PFA或丙酮室温或4度固定都可以，10～15分钟。之后可按组化常规方法进行。封片时将有细胞的面向下盖在载玻片上即可。 另外，用丙酮固定细胞的同时即对细胞膜进行了打孔的步骤，如果用PFA进行固定，则需要再使用打孔剂打孔（细胞内表达）。使用过氧化氢去除内源性过氧化物酶时，细胞要比石蜡切片的组织反应强烈，偶尔会掉片。