利用流式细胞仪分析细胞存活率、细胞周期、-ROS.pdf

利用流式细胞仪分析细胞存活率利用流式细胞仪分析细胞存活率、细胞周期细胞周期、ROS（以 6 孔板为例）测定细胞存活率测定细胞存活率1.取对数生长期的细胞,以 4105/ml 密度接种于 6 孔细胞培养板上；2.培养过夜后，用于相应实验处理；3.收集处理后的细胞培养液至流式专用管；4.加1ml PBS缓冲液清洗一次，清洗液加入管中；5.胰酶消化收集细胞于上述管中；6.1ml PBS缓冲液清洗剩余细胞一次，清洗液加入离心管；注注：36步都收集于同一流式专用管。7.800 g离心6 min，去上清；8.加1 ml PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清；9.最后重悬细胞于500 l含5 g/ml碘化丙啶(propidium iodide,PI)的PBS缓冲液中；10.避光冰上孵育10 min,用流式细胞仪测定细胞存活率；11.PI可结合DNA，在一定波长的激发光作用下可发出荧光，其强度与DNA含量成正比，但其不能透过完整的细胞膜。而FS（前向散射）则是指示细胞大小的参数。因此，我们以FS为横坐标，PI的荧光值的对数（log PI）为纵坐标，就可将不同大小和不同荧光强度的细胞区分开：活细胞表现出较大的FS值和较弱的荧光强度；坏死的细胞碎片，由于丢失部分DNA，具有较小的FS值和较弱的荧光性；凋亡细胞的细胞膜具有通透性，细胞虽然聚缩变小，但核保持完整，所以显示出较小的FS值和较强的荧光强度。通过计算活细胞占所有细胞的百分率，即可得知细胞存活率。测定细胞周期测定细胞周期1.细胞的处理及收集同测定细胞存活率方法的第 1-8 步；2.用 300 l 的 PBS 重悬细胞，将细胞逐滴加入 700l 预冷的无水乙醇中，乙醇终浓度为 70%，4避光固定过夜；3.800 g 离心 10 min，去上清；4.PBS 清洗两次；5.重悬细胞于 500 l 含 100 unit/ml RNaseA 的 PBS 缓冲液中，避光 37孵育30 min；6.加 2 mg/ml PI 至终浓度 50 g/ml，避光孵育 30 min，7.以 PI 荧光读数为横坐标，细胞数为纵坐标，在流式细胞仪上计数细胞周期各期的细胞数目。测定胞内测定胞内ROSROS的积聚的积聚1.细胞的处理及收集同测定细胞存活率方法的第 1-8 步；2.重悬细胞于 1ml 的 PBS 缓冲液中；3.加荧光探针如 CM-H2 DCFDA（主要检测 H2O2，1 mol/ml），37孵育 30min；4.在流式细胞仪上以 FS 和 SS（侧向散射，指示细胞光透射程度）为参数，选取活细胞（大 FS 值，较小 SS 值），将其限定在 Gate 内，对 Gate 内的细胞进行 ROS 的分析。以相应荧光探针荧光读数的对数为横坐标，细胞数为纵坐标即可测定活细胞的 ROS 的相对强度。