产志贺样毒素大肠埃希菌1类整合子的鉴定和分析.pdf

http:/ 产志贺样毒素大肠埃希菌 1 类整合子的鉴定和分析1李咏梅，李凡 吉林大学基础医学院病原生物学教研室 长春，130021 Email：摘 要:摘 要:本文通过常规分离出大肠埃希菌、血清学分型，PCR 法鉴定产 stx1-2 毒素性菌株；纸片扩散法对 17 种抗生素进行耐药性监测和分析；PCR 法鉴定 1 类整合子阳性株；PCR 产物测序并对结果进行分析，以了解 1 类整合子在产志贺样毒素大肠埃希菌中的分布，阐明整合子中耐药基因盒的种类及相互关系。结果表明各种标本中共鉴定出 46 株产志贺样毒素大肠埃希菌，其中 23 株为 O157：H7;全部 STEC 对复方新诺明耐药，对链霉素耐药率为 28.3%，氨苄西林为 30.4%，而且有 5 株对至少 4 种以上抗生素多重耐药，耐药谱为复方新诺明-链霉素-氨苄西林。46 分离株中有 11 株(23.9%)鉴定出 1 类整合子,PCR 产物测序得知 9 株携带 aadA1 基因盒,2 株携带 aadA2 基因盒，传递对氨基糖苷类抗生素的耐药性。结果证实产志贺样毒素大肠埃希菌存在 1 类整合子及其相关的基因盒，而且与氨基糖苷类抗生素的耐药性可能有关。关键词：关键词：志贺样毒素；大肠埃希菌；整合子 1引 言 1引 言 细菌耐药性的迅速蔓延及扩散，给临床感染性疾病的治疗带来了巨大的副作用。已经证实的两种参与耐药基因扩散的机制，即耐药性质粒及转座子在其中起着重要的作用1。近年来，第三种耐药基因的扩散机制已被发现，即整合子（integron），一种通过特异重组位点介导耐药基因整合的DNA元件。这种重组系统依赖两个决定子，一是编码特异位点DNA整合酶（integrase）的int基因2；二是被整合酶识别，并作为插入基因接受者的相邻位点，即attI(integron attach)位点。而插入的基因包含着被叫做基因盒(gene cassette)的可移动元件，大多数都表达耐药性。迄今为止，根据int基因的不同，已有 4 类整合子得到了鉴定，大多数临床分离株及革兰阴性杆菌中存在着 1 类整合子3。其由两个保守片段组成，5-CS包含int基因，attI位点和共同的启动子Pant，而 3-CS包含一个耐杀菌剂的基因（qacE1），一个磺胺基因（sul1）和一个未知功能的开放读码框（orf5）。中央可变区域包含不同的基因盒组合，至少 70 种不同的耐药基因盒已被发现，它们在种内及种间转移，使宿主菌成为广谱耐药性细菌4。产志贺样毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing E.coli，STEC）是引起大规模食源性食物中毒的主要病原菌5。STEC中有 100 余个血清型的致病性大肠杆菌可以致病，主要血清型是O157：H7，可引起非出血性腹泻，出血性结肠炎（haemorrhagic colitis,HC），溶 1本课题为高等学校博士学科点专项科研基金资助课题，编号为 30271251-1-http:/ 血性尿毒综合症(haemolytic uraemic syndrome,HUS)。尽管STEC所引起的腹泻多数是自限性的，但是早期应用抗生素进行治疗，可以减少发展成HUS的病例，不良后果则是EHEC多药耐药菌株的增加6。国外已有资料表明，耐药整合子在临床分离株中比较常见，而在我国未见对此方面的报道，本研究主要阐明各种来源的产志贺样毒素大肠埃希菌中耐药整合子的分布、特征、所含基因盒的状况以及所表达的耐药信息。2材料和方法 2材料和方法 21 菌株 21 菌株 经常规分离，PCR 鉴定毒力基因，从环境、动物粪便及临床标本中分离鉴定出 46 株产志贺样毒素的大肠埃希菌，其中 23 株为 O157：H7。标本来源于吉林市防疫站、长春市儿童医院、北京流行病研究所和美国马里兰大学。质控菌株 大肠埃希菌 ATCC25922，金黄色葡萄球菌 ATCC25923，铜绿假单胞菌 ATCC27853，吉林大学基础医学院病原生物学教研室提供。整合子阳性菌株由美国马里兰大学馈赠。22 耐药性监测 22 耐药性监测 采用 WHO 推荐的纸片扩散法，对 46 株菌株进行 17 种抗生素的敏感性试验，根据 NCCLS进行结果的判定。23 PCR 鉴定 1 类整合子 23 PCR 鉴定 1 类整合子 131 引物序列131 引物序列5 见下表，均由上海生物工程公司合成。表 1 整合子、整合酶和 sul1 基因引物序列 基因 引物序列 Class1-F 5-GGCATCCAAGCAGCAAG -R 5-AAGCAGACTTGACCTGA IntI-F 5-CCTCCCGCACGATGATC -R 5-TCCACGCATCGTCAGGC sul1-F 5-CTTCGATGAGAGCCGGCGGC -R 5-GCAAGGCGGAAACCCGCGCC 132 PCR 扩增 132 PCR 扩增 DNA模板的制备 取单个细菌培养菌落，加500ul生理盐水，100煮沸10min，14000rpm离心，上清即可用作 DNA 模板。扩增 反应体系为 50ul，含有 10PCR 反应 buffer，200uMdNTPs，引物各 10uM，1UTaqDNA聚合酶（均购于北京鼎国公司）。整合子扩增条件为 95变性 10min，然后 951min552:30min721min，30 个循环，最后 72延伸 10min。整合酶基因扩增条件为 94变性10min 然后 941min541min722min，30 个循环，最后 72延伸 10min。sul 基因扩增时，复性温度为 59，其他均同整合酶基因扩增条件。产物经 2%的琼脂糖凝胶电泳，EB 染色后，凝胶成像系统观察、记录分析结果。-2-http:/ 24 DNA 测序及序列分析 24 DNA 测序及序列分析 将整合子的 PCR 产物纯化后进行 DNA 测序（由上海生物工程公司完成），结果登录GenBank 并用 BLAST 软件进行分析。3结果 3结果 31 耐药监测结果 31 耐药监测结果 见表 2 表 2 46 株 STEC 对抗生素的敏感试验结果 抗生素 敏感 耐药 R（%）氯霉素（C）44 2 4.3 奈替米星（NET）42 4（2*2）8.7 氨曲南（AZT）36 10（5*5）21.7 奥格门丁（AMX/CA）39 7（2*5）15.2 头孢克罗（CEC）39 7（2*5）15.2 复方新诺明（SXT）0 46（23*23）100 哌拉西林（PIP）40 6 13.0 头孢吡肟（FEP）42 4 8.7 头孢噻吩（CF）40 6 13.0 头孢曲松（CRO）41 5 10.9 头孢唑啉（CZ）40 6 13.0 庆大霉素（GM）40 6 13.0 四环素（TE）37 9（4*5）19.6 呋喃妥因（FT）43 3 6.5 诺氟沙星（NOR）41 5（1*4）10.9 氨苄西林（AM）32 14（3*11）30.4 链霉素（S）33 13（6*7）28.3 注：*为 O157 型 STEC 耐药株 32 整合子、整合酶及32 整合子、整合酶及sul1sul1基因分布情况 基因分布情况 46 分离株中有 11 株(23.9%)鉴定出 1 类整合子、整合酶及sul 1基因，10 株含有单个整合子，MW 为 1kb 左右，只有一株含有两个整合子，即 1kb、0.7kb，见图 1 和图 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1200bp 900bp 700bp 500bp 300bp 100bp 图 1 1 类整合子扩增结果-3-http:/ 1 孔为 DNA Mark，2 孔为阳性对照，3-13 分别为样本阳性孔，14 为阴性对照孔。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1200bp 900bp 700bp 500bp 300bp 100bp 图 2 1 类整合子、整合酶和 sul1 PCR 产物电泳结果 1 孔为 Mark，2、6、10 孔分别为整合子、整合酶和 sul1 基因的阳性对照，3-4、7-8、11-12 分别为样本阳性孔，5、9、13 为阴性对照孔。33 DNA 测序 33 DNA 测序 纯化的整合子 PCR 产物，经测序后，将结果输入 GenBank，用 BLAST 软件分析并进入gi48205 和 gi40880，得出的 9 株含有 aadA1 基因盒，2 株含有 aadA2 基因盒，分别决定着对链霉素等氨基糖苷类抗生素的耐药性。3讨论 46 株 STEC 阳性菌中，除 5 株来源于临床分离株外，其余均从环境标本（污水）、家畜、家禽粪便以及食品中分离鉴定出，并监测到耐药性的存在。提示应该加强食品卫生的监督和管理以及合理在家养动物中使用抗生素，以减少食源性 STEC 型食物中毒的可能性和抗生素的选择压力。46 株STEC中，有 11 株(23.9%)经PCR鉴定出 1 类整合子以及 5CS和 3CS的整合酶和sul 1基因，2 株（5：2，40%）临床分离株 1 类整合子阳性。而西欧国家的临床革兰阴性分离株中，1 类整合子的鉴定率则是 43%7，在新西兰、法国分别是大于 50%和 59%，基因盒的种类最多可达 5 种8、9，可在美国，耐氨基糖苷类抗生素的临床分离株中，1 类整合子的鉴定率高达 75%，有 1 株竟含有 7 种基因盒 10。综合以上资料表明，国外分离株中 1 类整合子的鉴定率明显高于本试验结果，而且所含有的基因盒种类也明显多于本试验。可能是因为本研究所收集分离的STEC菌株，多数来源于动物粪便及环境标本，相对于临床分离株来说，接触抗生素的复杂性略低一些，也进一步表明 1 类整合子较广泛地分布于各种来源的分离株。而且环境标本中整合子的鉴定率决不容忽视，其可能是食源性致病菌耐药性形成的源泉。同时也间接提示细菌耐药性的形成与抗生素的选择压力有关。在鉴定出的整合子中，含有的aadA1,aadA2,基因盒，也见于澳大利亚有关尿道E.coli分离株的报道11，表明同样的基因盒可以在世界范围内，不同的地域、人类、动物宿主及菌间扩散和传递。提示在人类、动物及外周环境之间的微生态系统中，有关细菌耐药性迅速交-4-http:/ 叉和蔓延的问题应该引起重视，更重要的是发现新的耐药基因和控制其表达则可能是解决耐药性的途径之一。参考文献 1Stokes HW,Hall RM.A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions:integrons.Mol Microbiol 1989.3:1669-1683.2Hall RM,Collis Cm.Mobile gene cassettes and integrons:capture and spread of genes by site-specific recombination.Mol Microbiol;15:593-600.1995.3Rowe-Magnus DA,Guerout Am,Mazel D.Bacterial resistance evolution by recruitment of super-integron gene cassettes.Mol Microbiol.2002.43(6):1657-69.4Peter A.Current status of the aad and dfr gene cassettes families.J Antimicrob Chemother.2001.47,495-496.5Meng,J.,Zhao,S.,and Doyle,M.P.1998a.Virulence genes of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from food,cattle and humans.Int.J.Food M