五种血小板抗体检测方法的比较及其优化.pdf

磊铆戈学同等学力申请硕士学位论文(2 0 0 5 届)五种血小扳抗体检测方法的比较及其优化C o m p a la t i v cs t u d i e sb y f i v e m e t h o d sa n d m o d i f i c a d v ea p p l i c a l i o n0 1 1d c t c c t i o no f p l a t e l e ta n t i b o d i e s研究生姓名指导教师捌名申请学位级别周晓华专业名称鱼垂堂一研究方向血液免症论文提交日期20 0 5 年1 0 月亘独堡生!攮埴住撞到壶洼鲍坦篷噩基落也虫窑摘差五种血小板抗体检测方法的比较及其优化中文摘要目的：血小板制品的广泛使用，大大减少了由于血小板减少所引起的致命出血性死亡病例的发生。然而，长期的血小板输注可能带来血小板输注无效的严重后果，从而导致输入的血小板功能无法得到充分的发挥。血小板的采集操作过程、病人的病情以及免疫因素是引起血小板输注无效的主要原因。至今，由免疫因素引起的血小板输注无效成为比较重要的限制血小板正常输注的因素之一。因此，同种免疫和血小板输注无效将成为血小板输注过程中始终困扰临床的一个问题。所以，如何找到一个有效的针对病人血小板抗体特异性的检测方法至关重要。方法：由于大多数的抗体是H L A 抗体，因此本研究应用下列5 种血清学方法对6 7例非血小板自身存在疾病的输血病人的血液标本进行了检测。(1)固相酶联免疫吸附试验(E L I S A 方法)，该方法运用亲和层析分离手段，用从数百份血小板混合制剂中提取的H L A 抗原来检测病人血清中的H L A 特异性I g G 抗体；1 2)糖蛋白特异性单克隆抗体固相血小板抗体试验(M A S P A T)，其原理应用免疫吸附试验来进行检测；(3)流式细胞术，该方法运用免疫荧光技术来进行血小板交叉配血和抗体检测，这有助于预测有免疫抗体的病人输注A B O 配合的血小板后所产生的临床效果；(4)微柱凝胶法(M C G T)，该方法比较方便；(5)简易致敏红细胞血小板血清检测(S E P S A)方法进行检测和筛选血小板抗体。通过对以上5 种检测方法的比较来分析它们之间的优劣。在此基础上对M C G T 方法进行了优化，并把它和M A S P A T 方法进行了对比性研究。另外，我们还建立了有7 5 5 名苏州的互不相关人群组成的血小板供者库，用于提供H L A 匹配的血小板给相关的病人，血小板供者库的H L A A 和H L A B 位点运用P C R S S P 技术进行了检测。结果：M A S P A T 法样本组中检测到的抗体阳性率为8 9 6，与文献报道的结果相符。E L I S A 方法可以区分H L A 抗体和非H L A 抗体，其敏感性和特异性接近于M A S P A T 方法。亘拉堡尘拖拉链撞泌壶洼鲍盥轻噩甚煎也虫奎摘要流式细胞术很敏感，对于非免疫因素不存在时，用该方法交叉配血可得到很好的试验结果。虽然这些方法无法鉴定H L A 抗原的特异性，但它们的反应强度保证了实验的敏感性。所有以上的试验方法均比S E P S A 方法敏感，而微柱凝胶法有其方便实用的特点，但其假阳性的问题始终无法很好地解决。经过优化以后可与M A S P A T 方法媲美，优化后的方法与原方法比有很大的改善。此外，通过7 5 5 份样本的检测表明，苏州地区人群中，A 位点抗原频率较高的是A 2、A 1 l、A 2 4、A 3 3，分别是0 3 0 4 6、0 2 0 9 3、0 1 6 9 5、0 1 1 1 3，B 位点抗原频率较高的是B 1 3、B 4 6、B 5 1、B 5 8、B 6 0、B 6 2，分别是0 0 9 9 3、0 1 1 7 2、0 0 7 4 8、0 0 8 4 1、0 0 6 8 2、0 0 7 7 5。结论：通过对5 种血小板抗体检测方法的比较，认为M A S P A T 法、E L I S A 法和流式细胞术进行血小板抗体检测的方法均明显优于S E P S A 和未改良的M C G T 检测法。M A S P A T 法与E L I S A 法的原理相似，只是两者所采用的判读显示形式不同，而灵敏性可与流式细胞仪检测技术相媲美，用M A S P A T 法检测多次输血病人中血小板抗体与文献报道的较接近。微柱凝胶检测法由于其方便简捷的特点越来越受到欢迎，在红细胞血清学抗体检测方面应用已经非常广泛，因此把它引入到血小板抗体检测中来就有其必然性。但由于血小板本身有易活化自凝聚的特点，往往影响到其最终结果的判读。使用血小板保存缓冲液，同时把孵育时间和温度进行适当的调节，杜绝了假阳性的发生，从而解决了以上所涉及难题，确保了整个检测过程的顺利完成。微柱凝胶优化方法与M A S P A T 法检测结果相似，但操作更容易方便，实验时间短，结果判读直观，重复性较好，所用仪器要求也不高，实验试剂成本较低，值得推广运用。由于H L A 抗体同种免疫而引起的血小板输注无效的病人通常给予输注H L A 匹配的或经过交叉配血的血小板，通过配合试验以后选择性地输注相容的血小板，可达到非常好的效果。这种根据病人H L A 抗体特异性来选择血小板的方法称为抗体特异性预测法(A S P)，但是，运用这种策略，对于某些病人来说，相容的血小板并不是常常能找到。血小板交叉配血的一个缺点就是配好的血小板保存期只有5 天，所以对于需要垂独查型!堑抗住撞测直萱的 E 筮星甚选垡生塞擅要长期输注血小板的病人来说，交叉配血试验必须经常进行。而用H L A 基因位点匹配的血小板可以有效地减少这方面的问题。然而，H L 卜A、B 位点匹配的血小板或没有任何不相容或交叉反应性的o n,j,板常常是难以找到的，所以保证血小板供者库中有足够的供者数就显得非常重要。鉴于面对这些疑难病例很难找到特别有效的对策和方法，所以采用有效的预防措施如滤除白细胞或用辐照的方法去除血小板中的白细胞的方法来减少或防止同种免疫的发生。血小板输注无效是血小板输注过程中一个难以回避的问题，会影响各种各样不同的病人。它也与疾病的诊断治疗、早期的免疫刺激因素或血液制品的类型有关。随着去白细胞血液制品的广泛使用，同种免疫引起的血小板输注无效的发生的几率也许会逐步降低。关键词：血小板；抗体检测；M A S P A T；微柱凝胶；H L A：P C R；输血无效硕士研究生：周晓华导师：张学光真挫查!j!扳抗然撞到直洼曲 E 粒里甚垡生匕墓奎摘要O o m p a r a t i v es t u d i e sb yf i v em e t h o d sa n dm o d i f i c a t i v ea p p Ii c a t i o no nd e t e c t i o no fP I a t e I e ta n t i b o d i e sA b s t r a c tO b j e c tv e：I m p r o v e m e n t si nt h ea v a i l a b i l i t ya n dq u a l i t yo fp l a t e l e tt r a n s f u s i o n sh a v em a r k e d l yr e d u c e dt h em o r b i d i t ya n dm o r t a l i t ya s s o c i a t e dw i t hi n t e n s i v em y e l o s u p p r e s s i V et h e r a p y T r a n s f u s i o no fp l a t e l e tc o n c e n t r a t e s(P C)r e d u c e dt h ei n c i d e n c eo ff a t a lh e m o r r h a g e si ns e v e r a lt h r o m b。c y t o p e n i cc o n d i t i o n s U n f o r t u n a t e l y，l o n g t e r mp l a t e l e ts u p p o r t i v ec a r em a yb ec o m p l i c a t e db yt h ed e v e l o p m e n to fas t a t eo fr e f r a c t o r i n e s s，r e s u l t i n gi ni n a d e q u a t er e c o v e r yo ff u n c t i o n a lp l a t e l e t s P Ch a n d l i n g，c l i n i c a lc o n d i t i o n so ft h ep a t i e n t sa n da l l o i m m u n i z a t i o na r et h em a i nf a c t o r sa f f e c t i n gr e f r a c t o r i n e s s S o，n o w a d a y so n eo ft h em a i n1 i m i t i n gf a c t o ri np l a t e l e tt r a n s f u s i o nt h e r a p yi st h ed e v e l o p m e n to fa l l o i m m u n i z a t i o n A 1 l o i m m u n i z a t i o na n dr e f r a c t o r i n e s st op l a t e l e tt r a n s f u s i o nw i l lr e m a i nas i g n i f i c a n tc l i n i c a lp r o b l e mi nt h el o n gt e r m S oi ti sv e r yi m p o r t a n tf o ru st of i n dau s e f u l m e t h o dt od e t e r m i n et h es p e c i f i c i t yo fp a t i e n t s p l a t e l e ta n t i b o d i e sa n db eo fb e n e f i to ft op a t i e n t so fp l a t e l e tt r a n s f u s i o n s M e t h o d s：A sm o s to fa n t i b o d i e sa r eH a l s，t o6 7u n r e l a t e dc a s e s，s e v e r a ls e r o l o g i ca s s a y sh a v eb e e nc o m p a r a t i v e l ys t u d i e d：As o li d p h a s e，H L A s p e c i f i ce n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y(E L I S A)t h a td e t e c t st h ep r e s e n c eo fi m m u n o g l o b u l i n(I g)Ga n t i H L Aa n t i b o d i e su s e sp u r i f i e dH L Aa n t i g e n sp r e p a r e db ya f f i n i t yc o l u m nc h r o m a t o g r