HE染色光镜观察法在脑组织形态学研究中的应用-常颖慧.pdf

HE染色光镜观察法在脑组织形态学研究中的应用常颖慧1,樊小农2,3,石学敏3(11天津中医药大学,天津 300193;21天津市针灸研究所 天津市针灸学重点实验室,天津 300000;31天津中医药大学第一附属医院,天津 300193)摘 要:HE染色光镜观察法是生物、医学基础研究中最基本的研究方法之一。通过复习整理针刺干预对相关神经系统疾病大鼠模型病理变化的影响,并与免疫组化染色法比较,了解 HE染色方法在中医针灸作用机理研究中的地位和作用。表明 HE染色方法可以在同一个视野下同时观察大鼠脑组织的多种指标变化情况,以整体判断大鼠脑的功能状态,和免疫组化染色法相比具有观察直观,操作简便易于掌握,而且经济节省时间的特点,明确 HE染色光镜观察法作为一种最基础的方法在脑组织形态学的研究中有着其不可替代的优势。关键词:脑组织;HE染色;染色方法;比较中图分类号:R-33 文献标识码:A 文章编号:1000-1719(2010)05-0777-03HE Staining And L ightM icroscopeObservationM ethod Used in Researches of Brain T issueCHANG Ying-hui1,FAN X iao-nong2,3,SH IXue-min3(11T ianjin university of TCM T ianjin 300193,China;21TianJin acupuncture research institute,TianJin acupuncturefocalpoint laboratory;31FirstTeachingH ospital of Tianjin University of Traditional ChineseM edicine)Abstract:HE staining then observed under lightm icroscopemethod is a basic observation method in biological andmedicalresearches.In this article,we analyzed the acupuncture effect on ratmodelwith nervous syste m diseases in pathology,and co m-pared w ith i mmunohistochem icalstaining.HE staining method plays an i mportant part in acupuncturemechanis m.W ith thismeth-odwe can observemany targets of the rat brain tissue under one vision field,in order to esti mate the overall functional status ofthe ratbrain.W hen co mparedw ith i mmunohistoche m ical staining,it has the feature of intuitive,user-friendly and easy to master,econom ical and ti me-saving.As one of the basicmethod,HE staining w ithm icroscope observation has its own advantages and cannot be replaced.K ey words:Brain tissue;HE Staining;Stainingmethod;Comparison收稿日期:2009-09-01基金项目:国 家 重 点 基础 研 究 发 展 计 划(973 计 划)资助 项 目(2006CB504500,2006CB504504);天津市科技发展计划项目(043609811);天 津 市 高 等 学 校 科 技 发 展 基 金 项 目(20030113)作者简介:常颖慧(1984-),女,山东济南人,硕士,研究方向:针灸治疗中风病。通讯作者:樊小农(1967-),女,副主任医师,博士,研究方向:针刺手法量学及针灸治疗老年病的临床及基础研究。E-mai:l fanx ia-onong 动物实验研究是中医理论、作用机理研究中不可或缺的手段,而且随着中医现代化研究的进展,动物实验越发显示其重要性和普及性。虽然免疫组化光镜观察法、扫描电镜观察法、蛋白组学基因定量法等研究方法、实验技术的不断进展提升了研究深度、广度和可信度,但是并不能完全代替许多基本的实验方法和手段,病理形态学 HE观察方法就是其中重要手段之一,该方法具有观察直观,操作简便易于掌握,而且经济省时等特点。针灸对神经系统病变有较好的疗效,因此针刺治疗脑出血、脑梗塞、阿尔茨海默病、多发性硬化症、帕金森病等疾病的机理研究也较多。本文通过复习整理相关疾病模型本身的病理变化以及针刺干预后的病理改变,进一步了解 HE染色方法在中医针灸作用机理研究中作用及优势,以期充分发挥传统经典实验方法的作用,尤其在实验条件较差的基层医院可以用这种最基本的染色观察方法进行研究,利于普及推广。在加强中医机理研究中发挥积极作用。实验研究中,大鼠是制作各种疾病病理模型的主要对象。大鼠脑组织经石蜡切片 HE 染色后,光镜下正常的大鼠脑组织结构清晰完整,神经细胞密集,排列整齐,神经元胞浆丰富,淡染,胞核居中,核仁清楚,正常胶质细胞结构完整,排列紧密,核仁清晰,胞浆无红染,细胞周围间隙致密无水肿。1 HE染色光镜观察法111 对脑梗死模型的研究 大鼠脑梗死灶中心处可见大片神经细胞消失、稀疏,排列不规则、紊乱,数量减少,间质水肿疏松,神经细胞胞浆浓缩红染,胞核皱缩或溶解、碎裂,微血管呈红色条形的管型,凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染,形成致密质块,并可见凋亡小体,缺血组织中细胞肿胀,可见胶质水肿,胶质#777#辽宁中医杂志 2010年第 37卷第 5期 细胞稀疏变性,梗死灶周围胶质细胞明显增多。脑梗死不同时期的病理表现不同 1-2。超急性期,由于发病时间在 3h以内,所以病理表现以脑组织缺血缺氧使微血管通透性增高、出现脑组织血管源性水肿为主,镜下见神经元、胶质细胞(星形细胞)及微血管周隙均增宽、神经纤维网疏松,呈海绵状或空泡样;神经元出现皱缩的缺血特征而无坏死,表明此期行适当的临床治疗会获得满意的效果。缺血的早期(6h),以部分血管内皮细胞、神经细胞和星形胶质细胞肿胀为特点,急性期(6 24h)缺血区脑组织苍白,轻度水肿;坏死期(24 48h)炎性细胞浸润突出,脑组织水肿程度最明显;软化期(3天 3周)病变区液化变软;恢复期(3 4周)液化坏死的脑组织被吞噬、清除,胶质细胞增生,毛细血管增多。此外,还可以根据组织形态学变化判断模型缺血再灌注的时间,如罗勇等 3在大鼠 MCAO 模型中发现,MCAO3h:基底节外侧区、顶叶、颞叶皮质(部分累及)神经元出现缺血性损害,胞浆空泡形成,核固缩均质化,核周体消失等;MCAO3h/再灌注 3h:神经元缺血性损害加重,核固缩更明显,胞浆空泡加大,细胞间间隙加宽;MCAO3h/再灌注 6h:神经元缺血性损害进一步加重,核固缩更为明显,胞浆空泡进一步加大,细胞间间隙加宽更为明显。除了判断模型缺血再灌注的时间外,还可以对脑水肿情况进行分级 4:级,部分神经细胞及小血管周围间隙扩大;级,白质神经原纤维疏松离散,伴神经细胞及小血管周围间隙扩大;级,灰质神经原纤维疏松离散,伴神经细胞及小血管周围间隙扩大;级,灰质及白质神经原纤维均离散,伴神经细胞及小血管周围间隙扩大。112 对多发性硬化模型的研究 在多发性硬化大鼠EAE模型 HE染色可以观察炎性变化 5,脑室周围可以看到炎症细胞浸润和血管/袖套样0结构改变,可提示血-脑脊液屏障被破坏。EAE模型主要病理改变表现为血管/袖套样0改变:HE染色显示小血管周围大量炎性细胞密集环绕,呈袖套样,有的伴有周围白质组织密度下降,凌乱松散。病理变化与临床病情严重程度基本一致。HE染色法除了可以在实验中观察其组织形态学变化外,还可以用于组织学评估中6,按照部位的不同分别评估如下:(1)脊髓实质:0无炎细胞浸润;+少量炎细胞浸润;+较大量炎细胞浸润;+广泛炎细胞浸润。(2)血管:0无血管袖套;+每片有 1 2个血管袖套;+每片有 3 5个血管袖套;+每片多于 5个血管袖套。113 对痴呆模型的研究 痴呆的研究以血管性痴呆(VD)和老年性痴呆(AD)为主。由于血管性痴呆常累及海马 CA 1和 CA3区,因此以上二区的锥体细胞常作为血管性痴呆的主要测量目标。王蕊等 7复制了大鼠拟 VD模型,形态学观察发现模型组大鼠海马 CA1区细胞排列稀疏、杂乱、细胞线不清晰,锥体细胞明显减少、尼氏体减少。中药防治组 CA1区细胞线清晰,细胞排列紧密,数量明显增多,尼氏体丰富,仅见少量细胞变性坏死。由此可以作为药物疗效的评价标准。张毅等 8在急性注射 AB 的 AD 模型研究中也选择了脑组织形态学改变作为判定大鼠记忆能力的观察指标。HE染色观察神经细胞,正常大鼠海马各区神经元呈圆形、椭圆形或锥形,核浆比值大,细胞核为圆形或椭圆形,着色均匀为浅蓝紫色,核仁明显;而 AB25诱导的 AD 组大鼠海马各区可见较多的神经元胞体缩小,胞浆浓缩,核固缩,整个细胞深染成红色,神经元数量较正常组减少 9。因此可以观察大鼠记忆力的改变情况。蒋波等 10去卵巢雌鼠 AD 模型,观察长期雌激素缺乏对老年大鼠海马结构神经元形态和数量影响,大鼠海马 CA1CA3区锥体细胞数量众多,细胞排列紧密整齐,CA4区神经元胞体较大,排列较为松散,齿状回颗粒细胞数量众多,细胞排列紧密整齐,细胞轮廓与周围组织分界欠清晰,胞核为蓝色,胞浆淡红色。细胞计数的研究结果证明丢失的绝大多数是大神经元,但这项技术不能分辨小神经细胞和胶质细胞,而神经元的丢失又常伴有胶质增生,因此这种研究方法的欠缺是明显的 11,无法满足本实验要求。114 对帕金森病模型的研究 帕金森病 HE染色光镜下观察主要病理特征是:神经元变性、坏死、缺失,黑质致密带神经细胞数目的减少,残留神经细胞的皱缩,胞浆染色加深,尤以黑质致密部 DA 能神经元为著 12。6-OHDA 毁损纹状体 PD 模型大鼠 13,光镜下HE切片观察黑质细胞形态特点,正常黑质细胞体形较大,富含黑色素颗粒。SN c区 6-OHDA 毁损区域可见黑质细胞色素颗粒脱失染色加深,黑质致密带内神经细胞几乎消失,残存细胞萎缩,神经元胞浆浓染,神经细胞呈带状斜行排列。又如金泽14对帕金森病的疗效观察中发现模型组大鼠损毁侧的黑质及纹状体尾壳核部位的神经细胞脱失,残留神经元变性,部分细胞胞浆明显肿胀,空泡变性;电针组神经细胞数略有增多,细胞变性减轻,周边组织结构基本正常,无明显炎性浸润变性及坏死现象,由此可以观察电针的疗效。2 免疫组化光镜观察法HE染色光镜观察是在同一视野下,既可以初步观察细胞形态学改变,又可以计算阳性细胞数,还可以计数微血管数并测量其长度,这是免疫组化酶标记法不能做到的。免疫组化方法每次只能标记一个观测对象(指标),如数目有限,如果要一次标记两个以上的指标则操作难度较高,容易产生交叉现象影响实验结果,可重复性差。一般如果要观察多个指标,多采用每次标记一种指标,多次实验标记的办法,这种方法比较费时,经济造价高,操作复杂。与 HE染色法相比,不能直观的在同一视野下进行比较观察,无法了解脑组织整体的变化情况。脑缺血的实验研究中,N i等 15用2-VO方法制备大鼠脑缺血模型,观察各组大鼠脑缺血组织中 Survivin、VEGF蛋白和微血管密度(MVD)的变化 16。正常组和假手术组大鼠脑组织中 Survivin、#778#辽宁中医杂志 2010年第 37卷第 5期 VEGF仅有少