产耐热β-葡萄糖苷酶细菌的筛选与鉴定.pdf

第 卷 第 期 年 月工 业 微 生 物Indust ri alM i crobi ol ogy V ol N o Jun 作者简介：廖德芳（），女，硕士，E m ai l：l i ao_defang com。倡 通讯作者：；传真：；E m ai l：gyshi j i angnan edu cn。doi：桙j i ssn 产耐热-葡萄糖苷酶细菌的筛选与鉴定廖德芳，陈献忠，张 梁，王正祥，石贵阳倡（江南大学生物资源与能源研究中心，无锡）摘 要：从中国高校工业微生物资源和信息中心（CICIM-CU）菌种库的 株细菌保藏物中筛选出 株产-葡萄糖苷酶能力较高的细菌。通过 S rD N A 序列鉴定，初步确定其中有 株为嗜热溶胞土芽孢杆菌（Geobacillus sp ），其余为地衣芽孢杆菌（Bacillus li cheniform i s）。对其中编号为 FA 的地衣芽孢杆菌和编号为-的嗜热溶胞土芽孢杆菌进行了粗酶液酶学性质分析，发现地衣芽孢杆菌最适反应温度为 ，最适反应 pH 值为 ，该条件下测得粗酶液比酶活为 U桙m g；嗜热溶胞土芽孢杆菌最适反应温度为 ，最适反应 pH 值为 ，该条件下测得粗酶液比酶活为 U桙m g。通过菌体和菌落形态观察以及生理生化特征分析，进一步鉴定编号为 FA 的菌株为地衣芽孢杆菌。关键词：耐热-葡萄糖苷酶；细菌；筛选；鉴定 -葡萄糖苷酶（-gl ucosi dase，EC ）又称-D-葡萄糖苷水解酶，是纤维素酶系中一类重要的水解酶，它能够催化水解结合于纤维二糖和纤维寡糖末端非还原性的-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖。但是天然的纤维素酶普遍存在-葡萄糖苷酶活力低的缺陷，致使纤维素降解过程中纤维二糖积累，影响酶解效率。为了提高纤维素酶的整体活力，使其更好的应用于纤维素酒精等工业中，国内外对各种不同来源的-葡萄糖苷酶都进行了广泛的研究。已有报道过的-葡萄糖苷酶来源多为霉菌，和酵母，而来源于细菌的报道较少。由于酶的热稳定性在工业上具有很多优势，近年来从嗜热细菌中分离-葡萄糖苷酶逐渐引起了人们的兴趣。在以木薯等淀粉质原料生产酒精的过程中，原料中含有的纤维杂质经液化、糖化阶段会生成部分纤维二糖。耐热性的-葡萄糖苷酶与糖化酶（最适作用温度 ）协同作用可有效地将纤维二糖降解为葡萄糖，从而提高原料的利用率，减轻后续处理的压力。为了获得产耐热-葡萄糖苷酶的细菌，分别利用七叶苷和纤维二糖为唯一碳源在 培养条件下，从 株细菌中筛选出 株产酶能力较强的细菌。并对其中产酶能力较高的一株地衣芽孢杆菌和一株嗜热溶胞土芽孢杆菌进行了酶学性质的分析比较。1 材料与方法1 1 材料1 1 1 用于筛选的保藏样品 来源于江南大学工业微生物资源和信息中心（CICIM-CU，http：桙桙ci ci m cu j i angnan edu cn桙）。1 1 2 生化试剂 -硝基-D-吡喃葡萄糖苷（pN PG）购于 si gm a公司；七叶苷（Escul i n）、纤维二糖购自上海生工生物工程公司。1 1 3 其他材料 小麦草粉购于浙江上虞市万事达麦业有限公司；麦麸为市售麦麸经粉碎后过 目筛。1 1 4 仪器 ZDX-BI型座式电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），U V-紫外分光光度计（U N ICO公司产品），台式高速离心机（上海嘉定粮油仪有限公司）PHA 型高温培养箱（上海一恒科技有限公司），万方数据超声波破碎仪（天美科技有限公司），高效液相色谱仪Agi l entHP 系列（美国惠普公司）。1 1 5 培养基1 1 5 1 分离培养基（g桙L）柠檬酸铁铵 ，蛋白胨 ，K HPO ，M gSO ，琼脂 ，七叶苷 1 1 5 2 产酶培养基（g桙L）小麦草粉 ，麦麸 ，蛋白胨 ，K HPO ，M gSO 。1 1 5 3 纤维二糖培养基 添加 g桙L 纤维二糖的 M 培养基。1 2 方法1 2 1 初筛方法 将待筛细菌保藏物在 LB 培养基固体平板上划线，过夜培养以筛选出耐热细菌。然后挑取单菌落点种于七叶苷显色平板，过夜培养。以平板背面菌落周围的培养基颜色变为黑色为指标，选取目的菌株进行复筛。1 2 2 复筛方法 将初筛细菌分别接种于装液量为 m L 纤维二糖培养基的 m L 小试管，在 、r 桙m i n 条件下培养 h。取菌浓较高的细菌发酵液于，r 桙m i n 离心 m i n，分别收集上清液和菌体。上清液经过预处理后用 H PLC 法测发酵液中的残余的纤维二糖浓度；取菌体悬浮于 m L 的纤维二糖溶液，于 反应 m i n 后用 H PLC 法测定生成的葡萄糖含量。1 2 3 色谱条件 色谱柱 SH（Shodex）：流动相为 m ol 桙L硫酸，流速为 m L桙m i n，进样量为 L，柱温 ，压力 bar，检测器为示差检测器（A gi l ent）。1 2 4 菌种鉴定方法 用 S rD N A 序列比较法进行分子鉴定。具体方法如下：将接种后培养 h 的细菌按照文献中的方法提取总 DN A，并以该 D N A 为模板用 SrDN A 通用引物（上游：-A G A G TTTGA TCCTG-GCTCAG-，下游：-ACG GCTA CCTTG TT AC-GA CTT-）进行 PCR 扩增，产物回收纯化后进行DN A 序列测定。将所测得的序列与 Genebank 中的S rD N A 序列进行 Bl ast分析比较。PCR 反应程序为：、m i n，、m i n，、lm i n，、m i n，个循环后，延伸 m i n，保存。S rD N A 测序委托北京六合华大基因科技股份有限公司完成。1 2 5 纤维二糖转化率的测定 取菌体悬浮于 m L 含 纤维二糖的 m ol 桙L N aH PO m ol 桙L 柠檬酸缓冲液（pH ）（或取 m L 葡聚糖凝胶-G 脱盐柱处理后的发酵液加入 m L 含 纤维二糖、pH 为 的 m ol 桙L N aH PO m ol 桙L 柠檬酸缓冲液）于 下水浴保温 m i n 后煮沸 m i n 灭酶。用 H PLC 法测定所生成的葡萄糖含量。1 2 6 粗酶液的提取 将细菌接种于 LB 培养基于 ，r 桙m i n 条件下培养 h 后，r 桙m i n 离心 m i n 收集菌体。用无菌水洗涤两遍后加入 m ol 桙L N aH PO m ol 桙L 柠檬酸缓冲液（pH）震荡均匀，超声波破碎细胞。r 桙m i n 离心 m i n 取上清液测酶活力。1 2 7 蛋白含量测定 用考马斯亮蓝法测定粗酶液中的蛋白质浓度。1 2 8 pN PG 酶活力测定 参照文献测定粗酶液酶活力以研究其酶学性质。取粗酶液 L 于设定温度下恒温水浴 m i n，再加入 l已预热 m i n 的 m m ol 桙L的 pN PG 溶液计时 m i n，立即加入 m L m ol 桙L 的NaCO溶液中止反应，室温放置 m i n 后于 nm处测定光吸收值 OD。酶活力单位定义：在上述测定条件下，每 m L 粗酶液每分钟水解产生 m ol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位（U）。1 2 9 形态观察与生理生化实验 参照文献方法进行。2 结果与分析2 1 -葡萄糖苷酶产生菌的筛选与鉴定2 1 1 初筛 将来自江南大学工业微生物资源和信息中心（CI CIM-CU）菌种库资源的 株细菌保藏物活化后分别点种七叶苷显色平板，根据其黑色变色圈的大 第 期 工 业 微 生 物第 卷 万方数据小来初步确定细菌产-葡萄糖苷酶的能力（见图），一共从其中筛选出黑色圈较大的细菌 株。图 七叶苷显色平板图2 1 2 复筛 首先将 株细菌分成 组，将初筛菌株接种于产酶培养基在 、r 桙m i n 条件下摇床培养 h。将发酵液于 ，r 桙m i n 下离心 m i n，取上清液 m L 通过葡聚糖凝胶-G 脱盐柱处理后用H PLC 法测发酵液转化纤维二糖生成的葡萄糖含量。但实验结果显示葡萄糖含量均接近零，说明本次实验筛选到的细菌没有产胞外酶的能力或者产酶能力很低。用 m L 小试管分别对每株细菌发酵后，发现有 株细菌的发酵液中菌体浓度较高，其他菌体浓度很低。用 H PLC 法分别对这 株细菌发酵液中的纤维二糖残留量进行测定，结果有 株细菌的纤维二糖残留量接近 。然后用这 株细菌的菌体用无菌水洗涤两遍后直接测定纤维二糖转化率，用H PLC 法测定生成的葡萄糖含量。结果显示有 株细菌葡萄糖生成量为 g桙L 以上（如表 所示），而其他细菌葡萄糖生成量都在 g桙L 以下。表 菌体与纤维二糖反应生成的葡萄糖含量菌株编号 h 趑 F1A种 槝 葡萄糖含量桙（g桙L）h 趑 槝 2 1 3 菌种鉴定 分别以纤维二糖利用较快的 株细菌的染色体D N A 为模板，PCR 扩增其S rD N A 片段并进行测序，将测序结果与 Genbank 数据库进行 Bl ast分析。其中有 株细菌与嗜热溶胞土芽孢杆菌（Geobacillus sp ）的亲缘性最为接近，相似性为 以上。其他细菌的 S rD N A 序列与地衣芽孢杆菌（Bacillus li cheniform i s）的同源性为 以上。初步鉴定其中 株细菌为嗜热溶胞土芽孢杆菌，其余为地衣芽孢杆菌。2 2 粗酶液酶学性质分析 将全细胞转化纤维二糖生成葡萄糖含量较高的编号为 FA 的地衣芽孢杆菌和编号为-的嗜热溶胞土芽孢杆菌接种于 LB 培养基，于 、r 桙m i n 条件下摇床培养 h，离心收集菌体后用超声波法提取粗酶液并进行酶学性质的分析比较。2 2 1 粗酶液最适反应温度研究 将粗酶液用缓冲液调至 pH ，在不同温度下测其 pN PG 酶活力。由图 可知，来自嗜热溶胞土芽孢杆菌的-葡萄糖苷酶最适反应温度为 ，在 到 之间相对酶活力保持在 左右，超过 酶活损失较快，到 酶活基本丧失；来自地衣芽胞杆菌的该酶最适反应温度是 ，在 到 之间酶活保持在 左右，在 仍有 的酶活。这两种酶都具有一定的耐热能力，在协同糖化酶（最适作用温度 ）应用于淀粉质原料生产燃料乙醇的工业中具有研究价值。但相对前者而言，地衣胞杆菌的-葡萄糖苷酶与糖化酶的作用温度更加匹配。图 温度对酶活力的影响2 2 2 粗酶液最适反应 pH 的研究 将粗酶液冷冻干燥后用缓冲液分别调至不同pH 值（pH ，m ol 桙L N aH PO-m ol 桙L 柠檬酸缓冲液；pH ，m ol 桙L 碳酸钠-m ol 桙L 碳酸氢钠缓冲液），在最适反应温度下测其 pN PG 酶活力。结果如图 所示：嗜热溶胞土芽孢杆菌在 pH 至 之间相对酶活力保持在 第 期廖德芳等：产耐热-葡萄糖苷酶细菌的筛选与鉴定第 卷 万方数据 以上，而地衣芽孢杆菌在 pH 到 之间相对酶活力保持在 以上，比嗜热溶胞土芽孢杆菌具有更宽的 pH 反应区间。图 pH 值对酶活力的影响2 2 3 粗酶液热稳定性的研究 用 pH 为 的粗酶液在 水浴保温不同时间后测 pN PG 酶活力，结果如图 所示。嗜热溶胞土芽孢杆菌酶活力半衰期为 m i n 左右，而地衣芽孢杆菌酶活力半衰期为 m i n 左右。图 下酶活力的稳定性2 2 4 粗酶液 pH 稳定性的研究 将 pH 分别为 、和 的粗酶液于 水浴保温不同时间后于 测粗酶液的酶活力。结果如图 所示：pH 为 条件下嗜热溶胞土芽孢杆菌酶活力较稳定，半衰期在 h以上；而 pH 为 条件下地衣芽孢杆菌酶活力较稳定，半衰期为 h 以上。图 不同 pH 条件下酶活力的稳定性 实验结果表明，在最适反应温度与反应 pH 条件下，嗜热溶胞土芽孢杆菌粗酶液中-葡萄糖苷酶的比酶活为 U桙m g，地衣芽孢杆菌粗酶液中-葡萄糖苷酶的比酶活为 U桙m g。2 3 菌株的形态观察与生理生化鉴定 由于嗜热溶胞土芽孢杆菌属是 年才由N azi na等人对嗜热芽孢杆菌创立的新菌属。这个属包含的种分类复杂，对种的具体分类目前还没有定论，其形态、生理生化特征也没有一个统一的标准，而地衣芽孢杆菌的形态、生理生化特征在枟常见细菌系统鉴定手册枠中有具体描述。因此本实验针对分