新生大鼠成骨细胞原代培养与鉴定.pdf

中国组织工程研究 第17卷 第41期 20131008 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research October 8,2013 Vol.17,No.41 doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.41.003 http:/www.crter.org 程浩，张延芳，许巍.新生大鼠成骨细胞原代培养与鉴定J.中国组织工程研究，2013，17(41):7199-7204.ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN:ZLKHAH 7199 www.CRTER.org 程浩，男，1986 年生，山东省临沂市人，汉族，2013 年广东医学院毕业，硕士，主要从事骨质疏松方面的研究。 通讯作者：张延芳，博士，副教授，广东医学院信息工程学院物理教研室，广东省广州市 523808 中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344(2013)41-07199-06 收稿日期：2013-04-05 修回日期：2013-07-16(201305122/DC)Cheng Hao,Master,Department of Physics,School of Information Engineering,Guangdong Medical College,Guangzhou 523808,Guangdong Province,China Corresponding author:Zhang Yan-fang,M.D.,Associate chief physician,Department of Physics,School of Information Engineering,Guangdong Medical College,Guangzhou 523808,Guangdong Province,China Received:2013-04-05 Accepted:2013-07-16 新生大鼠成骨细胞原代培养与鉴定 程 浩1，张延芳1，许 巍2(1广东医学院信息工程学院物理教研室，广东省东莞市 523808；2 广西梧州制药(集团)股份有限公司，广西壮族自治区梧州市 543002)文章亮点：1 实验的特点在于采取 3 种方法即胶原酶消化法、分段胶原酶消化法及组织块法，从大鼠幼鼠颅骨中分离成骨细胞，区别于传统的一种或者两种方法。能更全面的确定胶原酶消化法是一种方便、高效、理想的原代成骨细胞分离培养方法。2 实验所用骨细胞分离部位为大鼠的颅骨，相对骨膜以及骨髓，颅骨面积较大且操作简单。现在成骨细胞原代培养方法众多，实验探索一种操作简便，既经济又高效的原代培养成骨细胞的方法，为进一步的实验研究奠定基础。关键词：组织构建；骨组织构建；成骨细胞；原代培养；胶原酶消化法；组织块法；胶原酶；成骨细胞鉴定 主题词：大鼠；颅骨；成骨细胞；细胞培养技术；细胞增殖；生长曲线表 基金资助：东莞市医疗卫生重点课题(2012105102006)*；东莞市医疗卫生一般课题(201210515200001)*摘要 背景：组织工程需要大量的种子细胞，成骨细胞是骨组织工程的重要种子细胞之一。但是成骨细胞培养难度大，不同培养方法得到的成骨细胞数量、纯度、增殖及分化活性各有区别。目的：验证及比较成骨细胞原代培养常用的 3 种方法，探索一种操作简便，既经济又高效的原代培养成骨细胞的方法，为进一步的实验研究奠定基础。方法：取新出生 72 h 内 SD 大鼠乳鼠颅骨，以胶原酶消化法、分段胶原酶消化法及组织块法分离成骨细胞，进行细胞形态观察、细胞化学染色、CCK-8 法绘制生长曲线及锥虫蓝排斥法计数活细胞率。结果与结论：分离培养的成骨细胞增殖良好，具备典型成骨细胞特性，细胞化学染色结果明显。胶原酶消化法比分段胶原酶消化法提取的成骨细胞数量多，细胞存活率高(P 0.05)；且比分段胶原酶消化法操作简单，耗时短。组织块法操作最为简单，对细胞损伤较小，但是细胞数量低、耗时长，很难用于大规模成骨细胞培养。胶原酶消化法是一种方便、高效、理想的原代成骨细胞分离培养方法。Primary culture and identification of neonatal rat osteoblasts Cheng Hao1,Zhang Yan-fang1,Xu Wei2(1Department of Physics,School of Information Engineering,Guangdong Medical College,Guangzhou 523808,Guangdong Province,China;2 Guangxi Wuzhou Pharmaceutical(Group)Co.,Ltd.,Wuzhou 543002,Guangxi Zhuang Autonomous Region,China)Abstract BACKGROUND:Tissue engineering requires a lot of seed cells.Osteoblasts have become important seed cells in bone tissue engineering.However,it is difficult to culture the osteoblasts,and cell number,purity,proliferation and differentiation activity are different obtained by different culture methods.OBJECTIVE:To identify and compare three common primary osteoblat culture methods,and to explore a method for the primary culture of osteoblasts which is easy to operate,economical and effective,in order to provide basis for the further experimental research.METHODS:Calvarias were dissected from newborn Sprague Dawley rats in 72 hours,and osteoblasts were isolated with collagenase digestion method,sequential digestion method and bone tissue method respectively.The morphological observation and cytochemical staining were performed,the growth curve of the cells was drawn with Cell Counting Kit-8 method,and the rate of living osteobalsts was counted with trypan blue staining.RESULTS AND CONCLUSION:The proliferation of the insolated and cultured osteoblasts was well with typical characteristics of osteoblasts,cytochemical staining results were positive.Compared with the sequential collagenase digestion method,the collagenase digestion method presented higher production of osteoblasts and higher cell survival rate(P 0.05),and the collagenase digestion method was easier than the sequential collagenase digestion method and cost less than sequential collagenase digestion method.Bone tissue method was the easiest method with less damage to cells,but bone tissue method presented lower production of osteoblasts and cost much more time,which cannot be used in large-scale osteoblast culture.The collagenase digestion method is a simple,efficient and ideal method for isolation and culture of primary osteoblasts.程浩，等.新生大鼠成骨细胞原代培养与鉴定 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 www.CRTER.org 7200 www.CRTER.org Subject headings:rats;skull;esteoblasts;cell culture techniques;cell proliferation;growth charts Funding:Key Medical and Health Project of Dongguan,No.2012105102006*;General Medical and Health Project of Dongguan Ctiy,No.201210515200001*Cheng H,Zhang YF,Xu W.Primary culture and identification of neonatal rat osteoblasts.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu.2013;17(41):7199-7204.0 引言 Introduction 由于各种原因(包括创伤或肿瘤等)造成的骨缺损、骨不连是临床上非常常见的疾病，其修复一直是医学界的棘手问题。组织工程学的创立和迅速发展为临床外科修复提供了一条新的途径，骨组织工程学的全面发展将为人类带来福音。骨组织工程需要的首要要素即种子细胞，成骨细胞作为直接成骨的细胞，是骨组织工程中的经典种子细胞来源2。不同来源的成骨细胞体外培养可以更好的了解成骨细胞在骨形成、骨重塑所起到的作用3。骨再生修复有3种基本机制,即骨形成、骨诱导和骨传导4。骨形成发生于再生期间,由预先存在的已分化或定向骨祖细胞进一步分化为成骨细胞来完成。现已广泛应用的自体骨和骨髓移植即为骨形成的例子5。骨诱导是在诱导刺激因子的作用下,使未分化的原始间充质细胞分化为骨祖细胞及成骨细胞。成骨细胞的分离培养方法主要有组织块法和酶消化法，主要取材部位为新生鼠长骨及颅骨6 1 材料和方法 Materials and methods 设计：细胞形态学与生物学特性实验。时间及地点：2010年7月至2011年2月在广东医学院基础医学院科技平台实验室完成。材料：实验动物：取新生72 h内SD大鼠若干只，不计体质量、不分雌雄，由广东医学院动物实验中心提供，实验动物许可证号：SCXK(粤)2008-0008。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。新生大鼠成骨细胞原代培养与鉴定实验的试剂与仪器：。实验将分别使用组织块法及两种不同的酶消化法共3种方法分离获取成骨细胞，探索出分离率高、耗时短、成活性好、操作方