人外周血淋巴细胞分离方法.pdf

人外周血淋巴细胞分离方法1.1.实验前准备实验前准备2.2.使用方法说明及图例使用方法说明及图例2.12.1 血液样本分离液使用说明及图例血液样本分离液使用说明及图例2.22.2 组织分离液使用说明及图例组织分离液使用说明及图例3.3.HES-TBD550使用说明HES-TBD550使用说明4.4.组织单细胞悬液的制备组织单细胞悬液的制备5.5.注意事项注意事项6.6.性能指标性能指标7.7.生产企业生产企业8.8.参考文献参考文献5.5.注意事项注意事项A 本分离液是敏光型的，在运输和贮藏过程中应在18-25避光保存，启封后置4保存避免微生物污染。另外，本品为真空包装，未启封前置于10 以下易出现白色结晶，影响分离效果。B 待分离的血液、组织及细胞要求新鲜，避免冷冻和冷藏。分离液和所分离样本一定在20水浴箱中复温20分钟保证分离液和所分离样本温度在202时分离效果最好，且所有操作过程一定要在无菌条件下进行。C 由于各品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季的差异，可能影响分离效果，用户可以调节离心转数，调节离心的时间，摸索最佳的分离条件（具体分离条件各实验室自定）。D 最好使用无静电反应的离心管，推荐使用未经过碱处理的玻璃离心管。E 最优抗凝剂选择：EDTA、枸橼酸、肝素。应注意在血液稀释过程中应去除抗凝剂体积。F 分离过程中所用其他试剂如：羟乙基淀粉550、全血及组织稀释液、细胞洗涤液及红细胞裂解液等以我公司产品为最优选择，本公司相关系列产品无菌、无病毒、无支原体、低内毒素水平且无细胞毒性，所获得的细胞可保持完好的生物活性和完整的细胞形态。6.6.产品性能指标产品性能指标pH 7.0-7.5渗透压 280-340mOsmol/kg内毒素内毒素 0.5EU/ml0.5EU/ml无菌 直接接种培养14天后培养基澄清澄明度及不溶性颗粒物澄明度及不溶性颗粒物 每50ml溶液中含10m以上的不溶性微粒20粒以下，含2每50ml溶液中含10m以上的不溶性微粒20粒以下，含25m以上的不溶性微粒5粒以下5m以上的不溶性微粒5粒以下贮藏及保存期限贮藏及保存期限18-25避光保存，有效期两年。启封后置4保存，有效期一周。注：注：若保证无微生物污染，启封后可置4长期保存。但应注意保存温度较低时本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。1.1.实验前准备实验前准备A 试剂淋巴细胞分离液、全血及组织稀释液、细胞洗涤液、羟乙基淀粉550、胎牛血清B 器材玻璃离心管、玻璃滴管水平转子离心机、无菌工作台2.2.使用方法说明及图例使用方法说明及图例2.12.1 血液样本分离液使用说明及图例血液样本分离液使用说明及图例A.A.小量分离-使用小量分离-使用1-2ml1-2ml新鲜抗凝血（分离图例见图例1）：新鲜抗凝血（分离图例见图例1）：a.取新鲜抗凝血1-2ml，与全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）1:1 混匀；b.小心加于与混合液等体积等体积的细胞分离液（货号：LTS1077）之液面上；c.以400g（约1500转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)；此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色淋第二层；为环状乳白色淋巴细胞层。巴细胞层。第三层；为透明分离液层。第四层；为红细胞层。收集第二层细胞第二层细胞放入含4-5ml细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃去上清留沉淀细胞留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。B.B.中量分离-使用中量分离-使用5-10ml5-10ml新鲜抗凝血（分离图例见图例1）：新鲜抗凝血（分离图例见图例1）：a.取新鲜抗凝血5-10ml，与全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）1:1 混匀；b.将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2：1）（混合液：分离液=2：1）；c.以500g（约1800转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)；此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色淋第二层；为环状乳白色淋巴细胞层。巴细胞层。第三层；为透明分离液层。第四层；为红细胞层。收集第二层细胞第二层细胞放入含10ml细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃去上清留沉淀细胞留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。C.C.大量分离I-使用大量分离I-使用20ml20ml新鲜抗凝血（分离图例见图例2）：新鲜抗凝血（分离图例见图例2）：a.取新鲜抗凝血20ml以200g（约1100转/分）离心20分钟弃去血浆；b.向弃去血浆的血细胞弃去血浆的血细胞中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）12ml 小心混匀；c.将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2：1）（混合液：分离液=2：1）；d.以600g（约2000转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)；此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色淋第二层；为环状乳白色淋巴细胞层。巴细胞层。第三层；为透明分离液层。第四层；为红细胞层。收集第二层细胞第二层细胞放入含20ml细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃去上清留沉淀细胞留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。D.D.大量分离II-使用大量分离II-使用50ml50ml新鲜抗凝血（分离图例见图例3）：新鲜抗凝血（分离图例见图例3）：a.取新鲜抗凝血50ml50ml与羟乙基淀粉550（HES-羟乙基淀粉550（HES-TBD550）液1:1混合后TBD550）液1:1混合后再与1份注射用生理盐水混匀20-30静置20-30分钟。吸取混浊的上清液混浊的上清液备用，弃去底部红细胞。b.将步骤1中留取的上清液上清液以200g（约1100转/分）离心20分钟弃去上清保留沉淀细胞沉淀细胞；c.向沉淀的细胞沉淀的细胞中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）20ml 小心混匀；d.将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2：1）（混合液：分离液=2：1）；e.以600g（约2000转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)；此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色淋第二层；为环状乳白色淋巴细胞层。巴细胞层。第三层；为透明分离液层。第四层；为红细胞层。收集第二层细胞收集第二层细胞放入含20ml细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃去上清留沉淀细胞留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需淋巴细胞。注：提取率大于90%。注：提取率大于90%。血液（人）中各细胞含量参考值：血液（人）中各细胞含量参考值：男：4.0-5.51012/L(400-550万个/mm3)女：3.5-5.01012/L(350-500万个/mm3)红细胞红细胞新生儿：6.0-7.01012/L(600-700万个/mm3)白细胞白细胞成人：4.0-10.0109/L(4000-10000个/mm3)新生儿：15.0-20.0109/L（15000-20000个/mm3)血小板血小板100-300109/L（10万-30万个/mm3)名称名称占白细胞总数百分比占白细胞总数百分比嗜中性粒细胞30%-70%嗜酸性粒细胞0.5%-5%嗜碱性粒细胞0%-1%淋巴细胞20%-40%白细胞分类计白细胞分类计数数单核细胞3%-8%分离图例3分离图例3抗凝血50ml与HES-TBD550 1：1混合后再与1份注射用生理盐水混匀20-30静置20-30分钟2.22.2 组织分离液使用说明及图例组织分离液使用说明及图例A取组织匀浆单细胞悬液（细胞浓度为2108-1109个/ml，具体制备方法参照“10.组织单细胞悬液的制备”）2ml，小心加于2ml细胞分离液之液面上；B以400g（约1500转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)；此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层；为胎牛血清液层。第二层；为环状乳第二层；为环状乳白色淋巴细胞层。白色淋巴细胞层。第三层；为透明分离液层。第四层；为红细胞层。收集第二层细胞第二层细胞放入含4-5ml细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃去上清留沉淀细胞留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需淋巴细胞。3.3.HES-TBD550使用说明HES-TBD550使用说明HES 是从支链淀粉衍生出来的，是富含淀粉的复合物，其生理和化学特性主要由羟乙基取代度即取代级、平均分子量决定。大量实验表明平均分子量越大对红细胞的凝集作用越强，有效提高红细胞的沉降速度，从而使红细胞与其它细胞分离。故而，使用HES-TBD550（羟乙基淀粉 550）沉淀法是一种高效的细胞分离方法。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是指一群可向成骨细胞、成脂肪细胞、骨髓基质细胞、肝脏细胞、心肌细胞和神经细胞等多种细胞分化的多潜能组织干细胞,是在细胞治疗、基因治疗中有效发挥作用的理想工程细胞。MSCs 不仅存在于骨髓,也可从脐血、外周血中以及脂肪组织、肌肉、胎儿器官、大脑、牙齿中分离。UCB-MSCs 的分离、筛选、增殖、分化与脐血样本的选择、培养基的差异以及分离、扩增分化过程中操作技术等多种因素有关。目前用于UCB-MSCs 分离的方法有:贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪法和免疫磁珠法。流式细胞仪法对细胞损伤较大，免疫磁珠法价格相对较贵且由于抗原抗体反应也容易改变细胞原有特性，而HES-TBD550（羟乙基淀粉 550）联合密度梯度离心法常与贴壁筛选法结合使用,可提高所得 UCB-MSCs 的纯度，目前研究多采用此法。国内不少学者采用羟乙基淀粉沉淀红细胞，然后再进行离心分离单个核细胞，也取得不错结果。实验证明采用随机数字表法，将每份脐血随机分入两个不同处理组，从而将脐血样本的个体差异减小到最小程度。结果证实，HES-TBD550（羟乙基淀粉 550）联合密度梯度离心法获得的有核细胞数量明显多于 FICOLL 密度梯度离心法。本实验采用的羟乙基淀粉商品名为 HES-TBD550（羟乙基淀粉 550），克分子渗透压为308mosmL，胶体渗透压为6836 mmHg,可影响红细胞集聚性沉降率。红细胞集聚是可递性桥接结构形成的结果，由大的HES-TBD550（羟乙基淀粉 550）分子处在红细胞之间联接而成。HES-TBD550（羟乙基淀粉 550）同时还阻碍白细胞和内皮细胞的黏附，并使平均血小板容积呈现微弱地降低，从而有轻度抑制血小板集聚的功能。脐血经HES-TBD550（羟乙基淀粉 550）处理后，可使红细胞沉积至试管底，对其它主要成分包括干细胞无影响。经这样处理后，实验时间相对较短（平均为1.5 h），步骤相对较少，细胞污染几率小，从而使细胞数损失减少。结论证明，与相应的干细胞分离液联合分离使用羟乙基淀粉沉淀法是一种高效的脐血干细胞分离方法。4.4.组织单细胞悬液的制备组织单细胞悬液的制备注：A.注：A.本说明只提供机械匀浆制备单细胞悬液的方法，酶消化法由于各实验室选取的消化酶种类本说明只提供机械匀浆制备单细胞悬液的方法，酶消化法由于各实验室选取的消化酶种类各不相同，请各实验室自行选择进行试验。各不相同，请各实验室自行选择进行试验。B.B.全过程及所需试剂要求无菌环境。全过程及所需试剂要求无菌环境。剪碎法：剪碎法：将组织块放入平皿后，加入少量组织匀浆液及20%胎牛血清；用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入5ml组织匀浆液及20%胎牛血清；用吸管吸取组织匀浆，用100目不锈钢滤网(另购)过滤到试管内；离心沉淀1500转/分3 min，再用细胞洗涤液清洗3次，每次以500rpm短时低速