包埋法固定化细胞技术的研究进展.pdf

!#收稿日期：$%$&!%&$!作者简介：肖美燕，!()#&*，女，在读硕士研究生，研究方向：微生物细胞固定化技术研究。包埋法固定化细胞技术的研究进展包埋法固定化细胞技术的研究进展肖美燕，徐尔尼，陈志文南昌大学生命科学与食品工程学院，南昌+%,)*摘要摘要：本文对包埋法固定化技术的特点，常用的包埋剂海藻酸钠、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、明胶、卡拉胶的包埋方法、改性研究及其研究与发展进行了综述，并对固定化细胞成型机械类型和固定化技术的应用前景进行了简要论述。关键词关键词：包埋法；海藻酸钠；聚乙烯醇；聚丙烯酰胺；明胶；卡拉胶；成型机械!#$%&$(!#$%&$(-./01 232145/01 603436/1478/768 9:7;93/79.?1./43227.31./8 341 7./49AB61A5/01;1/09A8 3.A A1C1=92;1./8 9:7;93/79.1AE F01:94;7.;3607.14?63/194718 3.A 322=763/79.:94149B.A 9:/01 7;91A 61=/160.9=9?341 3=89 7.6=BA1A 7./078 34/76=1E)*+,-%.#()*+,-%.#(1./43227.;1/09AG89A7B;37.3/1G29=?C7.?=3=6909=G29=?364?=3;7A 1=G1=3/7.G634D4311.7.G:94;7.;3607.14?中图分类号：H(+(I()文献标识码：J文章编号：!%$&KK+%$%+*%,&%!#&%,自从固定化技术问世以来，固定化技术正在以空前的速度向前发展，并不断完善。如今已涉及到酶固定化，细胞微生物，动物，植物*固定化，原生质体固定化，其固定方法也是多种多样，包括吸附法、包埋法、结合法、交联法以及后来出现的无载体固定法等。但是目前研究较多的是包埋法固定化技术，且其应用也比较成熟。包埋法是将酶或细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化酶或细胞的方法。根据载体材料和方法的不同，分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。凝胶包埋法是将细胞包埋在各种凝胶内部的微孔中而使细胞固定的方法。半透膜包埋法是将细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内而使细胞固定的方法。目前工业应用上以凝胶包埋法固定细胞最为广泛，主要是它具有以下特点：!方法简便，将细胞与单体或聚合物一起聚凝，细胞被包埋在形成的聚合物之中。条件温和，可选用不同的聚合物载体，不同的包埋系统和条件，以保持细胞的酶催化活性。#细胞不易渗漏，稳定性好。$有较高的细胞容量，聚合体中的细胞含量可达%L M)%L。!包埋方法与研究!I!海藻酸钠NJ*包埋法!I!I!方法将菌悬 液加入海藻酸钠溶液中充分混匀，然后用注射器将其滴入一定浓度的 O3O=$溶液中，得到白色小珠，将小珠浸泡在O3O=$中于冰箱内过夜，滤出小珠，洗净备用。!I!I$研究与发展目前，由于 NJ 凝胶机械强度较好，内部成多孔结构，对生物的毒性较小，其应用比较广泛。P Q3;B.3R!S等利用 NJ 固定枯$K,*：,&,#IR)SO946B:P5 J4B=Q5 T3;3 U 1/3=5 N/9431 9:1 O5 Z9?73/7 E Y1/03.9=5 1/03.9=3.A9/014 69;29B.A8 41/34A=13:81.1861.61 3.A 7;249C1/01 C381=7:1 B3=7/?9:6B/604?83./01;B.:=9148RQSE V98/034C18/W79=F160.9=5$%!5$+!*X)(&#+ER(SY34983.J5 N;7=3.76 Q _5 N7;9.8 U 1/3=E5 O9;7D.3/79.9:09/3/14 3.A 1/03.9=/9 69./49=298/034C18/A163?9:2136018 3.A.16/347.18EV=3./7813815!()5#!$*X!,%&!,%(ER!%S V1878 a5 U3B41 Y5 Y347.3.8?WJPE-.AB6/79.9:607=7./9=143.61 7.;3.9?/1;2143/B41 69.A7/79.7.5 013/5=9b$3.A 1/03.9=C329B48E J6/3 T94/5!()5,X K$(&K+,E$%+，Z9=E$,，c9E,!综述综述万方数据!#$%&，()*$+，,(*+!综述草芽孢杆菌细胞，结果表明固定化细胞在发酵产酶十次后，酶活都在$%-左右。郝建平.$/等用 01 固定柴胡细胞，王克明.&/用01 固定混合多菌种，都取得一定成功。在固定化过程中，细胞包埋量、海藻酸钠浓度、小珠的直径大小对固定化细胞的作用影响较大。曾胤新.+/将 2)克鲁维酵母 3 4 56!#$%&()$*&+,-./07 细胞加到$%2)$8 的 01中，再滴入到+8 的氯化钙溶液中，得到$22 左右的小珠，发现该法不仅制作工艺简单，而且机械强度较好，酶活保留率较高，但经多次发酵后，凝胶小珠体积膨大，颜色由白转为透明，机械强度明显降低，部分凝胶发生融化现象。9:;22 的珠体细胞酶活是 22 的珠体细胞的!+倍，可能是因为珠体越小，有利于珠内珠外之间营养交换。研究还发现，当所用氯化钙浓度为!8 时，酶活最高。9(?!8，C=C)$浓度为&8，获得的珠粒直径为$#22 的珠粒，结果发现苹果酸的消耗与游离的细胞相似，但乙醇浓度却提高了。王克明.D/以 01 为载体包埋固定紫色红曲霉 6 7(62+*#+,#,#&#+7 发酵生产红曲色素，研究最佳发酵条件，发现细胞接入量为$%8，01 浓度为+8，C=C)$浓度为+8 时，效果较佳。而陈九武.5/等采用 01 固定产酯酵母细胞，比较不同的 01 浓度在%$2()E FC=C)$溶液中固定化成球情况，发现适宜的载体浓度为!8 G&%8，并且当 01 浓度为$8 时，细胞增殖良好，产酯活性也最高。由于 01 包埋固定化细胞，凝胶珠机械强度和稳定性较差.+/，不利于固定化细胞的多次回收利用，有人将制备好的 01 胶珠用聚乙燃亚胺 4 戊二醛处理.#/，凝胶小珠机械强度大大增强，反应过程中不再有融化现象发生，但酶活性也急剧下降。王鲁燕.!%/则用%8 的戊二醛处理由 8 的 01 固定的细胞，发现效果较佳。有些人则向珠内加入添加剂，如黄豆粉，几丁质，脂肪酸麦角醇等.!/.!+/，增加其比重，减少发酵过程中凝胶珠上浮、崩溃，增强 01 凝胶珠的机械强度和稳定性。翁庆北.!/采用价廉的麸皮和 1)$H&为添加剂，制备固定化细胞，取得较好效果，发现固定化酵母细胞发酵+5I 后，产酒率较游离细胞高 5 D$8。吕晓猛.!B/等通过添加天然物质硅藻土和淀粉以及进行化学处理的方法对 01 珠体进行改进，提高珠体的机械强度和污水中十二烷基苯磺酸钠6F107 降解率，增加了珠体的抗腐败能力。研究结果表明，添加硅藻土和淀粉既能提高珠体对 F10 的降解率，又能增加机械强度，但随着硅藻土用量的增加，珠体吸附能力增加，吸附大量的大分子和水，使珠体体积膨胀，故硅藻土用量应控制在!J E!%2)左右较好。而淀粉虽然也能提高珠体的硬度和降解率，但由于它与 01 凝胶分子之间的粘附力较小，故经过 5I 以上的水力冲击，珠体中的淀粉易析出，因此不主张用淀粉作添加剂。同时，他们利用化学试剂对珠体进行改性研究，发现用己二胺 4 戊二醛处理过的珠体活性相对降低，但机械强度得到很大提高，延长了珠体的使用时间。!$聚乙烯醇6K17包埋法!$!方法将一定量的菌悬液与 K1 混匀，倒平板，加入饱和硼酸溶液，置冰箱内静置过夜。用手术刀切成小块状，用无菌水洗净备用。!$研究与发展由于 K1 具有高强度、化学稳定、强抗微生物分解性能、对微生物无毒、价格低廉等优点。近年来获得较广泛的应用。陈九武.5/等用 K1 固定细胞比较发现 K1 的浓度为!$8时固定化细胞相对活性及细胞增殖情况较好。刘智敏.!D/等用K1 固定枯草杆菌用于生产=4 淀粉酶发现使用!%8 的 K1，&8 的硼酸，包埋菌量为+8 G 58 时 K1 凝胶机械强度大，产酶能力高。由于 K1 凝胶颗粒具有非常强的附聚倾向，在制备珠体时比较困难，吕晓猛.!B/等通过加入 01 的方法来降低制备K1 珠体的难度，研究结果表明，在 K1 浓度为!$8，01 为!$8，所用的氯化钙的浓度为+8，固定+G 5I 后，制备的K1 珠体效果较好。李峰.!5/等也采用添加$8 的 01 来包埋细胞，所用的 K1 浓度为!%8，氯化钙的浓度为$8，获得的小珠直径为&22，包埋固定的小珠具有较高的细菌活性，较好的强度及传质性能。钟娅玲.!#/对 01 的添加量对 K1 珠体的影响进行研究，发现随着 01 添加量的增加，载体孔容增加，比表面积增大，但其载体机械强度大幅度下降，但当 01 浓度为!8 时，可在保证载体在长期耐机械搅拌的同时增加载体表面积，增加孔容，改善传质效果。由于 01 不适宜含有磷酸盐缓冲液的反应体系，为此，童群义.$%/等采用 K1 4 卡拉胶混合载体进行实验，研究发现在 K1 浓度为!%8，卡拉胶浓度为%8，成型剂的 LA值为 B+，包埋菌体量为%J E J，固定时间为&BI 时，固定化细胞具有较好的机械强度和较高的酶活力。陈敏.$!/用 K1 加少量的活性炭进行固定化研究，发现有助于颗粒成型，改善通透性，增加固定化颗粒的孔隙，达到吸附和包埋的双重效果。黄霞.$/等以 K1无纺布混合载体包埋固定化优势菌种用于降解吡啶，喹啉，异喹啉，结果表明，经固定化细胞处理 5I 后，三种有机物的去除率均达#%8 以上。取得较好效果。桥本奖.$&/等人在 K1硼酸法固定化过程中引入海绵状多孔性载体，减少了微生物活性损失。角立野夫.$+/等则在 K1硼酸聚合反应过程中引入丙烯酰胺聚合反应，使之在 K1 凝胶颗粒内部及表面形成聚丙烯酰胺网状结构，有效的改善了 K1 凝胶的水溶膨胀性。MN(4&聚丙烯酰胺包埋法!&!方法先配制一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙稀酰胺 6:O07 的溶液，与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，然后加入一定量的过硫酸铵61K07和四甲基乙二胺6PQ9QR7，混合后让其静置聚合，将凝胶块用手术刀切块，获得所需形状的固定化细胞胶粒。!&$研究与发展用聚丙烯酰胺凝胶制备的固定化细胞机械强度高，可通过万方数据!#$#%，&()$*，+)*!综述综述改变丙稀酰胺的浓度以调节凝胶的孔径，适用于多种细胞和酶的固定化，但是由于丙烯酰胺单体对细胞有一定的毒害作用，因此用它作为包埋剂的研究较少。王京炜,$-等对五种细胞固定化方法进行研究，发现用聚丙烯酰胺凝胶包埋的细胞生物效价最高，其固定条件为：细胞量!./0$#1(，加入 2)./0$#1(丙烯酰胺，#3./0$#1(456，再以*1(0$#1(的量加入.7 的 896 和四甲基乙二胺$滴，冰溶$#1:;。吴乾菁,$-等用聚丙烯酰胺固定酵母菌细胞去除污水中的镉离子，发现在最佳条件下固定化酵母菌对镉离子的去除率达 2=3 27，游离细胞只有%?,$=-等用 68 固定生枝动胶菌A!#$%&%()*&%B可去除镉溶液中 2.3 27 的镉离子。8 89CDE?;F,$2-将具有青霉素酰基转移酶活性的+,-#(细胞固定于聚丙烯酰胺凝胶珠中，其水解活性显著提高，且在使用 2#次后，其酶活也没有明显损失。!3*明胶包埋法!3*3!方法配置一定浓度的明胶悬浮液，加热灭菌后，冷却至%.G以上，与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，倒入光滑的培养皿中，置冰箱内冷凝$，取出凝胶，将其浸泡于戊二醛的生理盐水中!3.，再取出切割成!H$11 的颗粒，将凝胶颗粒置于戊二醛生理盐水静置!3.，滤出备用。!3*3$研究与发展曾胤新,*-对各种包埋剂固定化细胞产酶的效果进行比较，发现!#7 的明胶是较好的载体，不但制作工艺较为简单，而且机械强度好，该细胞产的酶活保留率较高，最适温度及稳定性也有所提高。陈少欣,%#-选择明胶、68、壳聚糖为固定化载体包埋产!I