新生大鼠心肌细胞的原代培养及鉴定.pdf

基础研究新生大鼠心肌细胞的原代培养及鉴定胡保奎，耿召华，祝善俊，刘玉峰(第三军医大学新桥医院心血管内科，重庆 400037)摘要目的:探讨新生大鼠心肌细胞原代培养的方法，培养存活率高和纯度高的心肌细胞。方法:无菌条件下取出出生 1 2 d 的 SD 大鼠心脏，用 2.5 g/L 胰蛋白酶和 2.0 g/L 型胶原酶等量混合液在 37条件下分次消化心肌组织。以差速贴壁并将时间延长至 90 min 纯化心肌细胞，48 h 后换液。结果:将心肌细胞24 h 贴壁生长，于2 3 d 心肌细胞伸出伪足，形成细胞簇，同步搏动，频率约 80 130 次/min，存活率为(93.9 2.8)%，纯度为(91.9 2.2)%。结论:以本实验的方法培养的心肌细胞存活率高、纯度高，是一种较为理想的原代心肌细胞培养方法。关键词:细胞培养;心肌细胞;大鼠中图分类号:329 2文献标识码:A文章编号:1009-7236(2014)06-654-03网络出版地址:http:/www cnki net/kcms/detail/61 1268 20130925 1833 006 html网络出版时间:2013-9-25 18:33基金项目:国家自然科学基金项目资助(81070093);重庆市科技攻关计划项目资助(CSTC，2011AC5031)通讯作者:耿召华，副教授，主要从事 ad 蛋白相关研究Email:gengzhh tom com作者简介:胡保奎，硕士生Email:641117506 qq comCulture and identification of cardiomyocytes in neonatal ratsHU Bao-kui，GENG Zhao-hua，ZHU Shan-jun，LIU Yu-feng(Department of Cardiology，Xinqiao Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400037，China)AbstractAIM:To develop a method of primary culture of neonatal rat cardiomyocytes with high survivalcell rate and high purity METHODS:Hearts of 1-to 2-day-old neonatal Sprague Dawley rats wereremoved under sterile conditions with 0.25%trypsin and 0.2%collagenase type II at 37 under theconditions of graded digestion myocardial tissue Differential adherence purification was applied Thetime was extended to 90 min and the medium was changed after 48 h ESULTS:Adherent growth ofmyocardial cells was observed at 24 h and pseudopodia growth at 2 3 days Myocardial cells formed cellclusters and the synchronous beat frequency was about 80 130 times/min with survival rate of(93.9 2.8)%and purity of(91.9 2.2)%CONCLUSION:We developed a method to culture myocardialcells with high survival cell rate and high purityKey words:cell culture;cardiomyocyte;rat心肌细胞培养是指在体外适宜条件下，给予心肌细胞生长所需的营养，使之稳定生长，但原代心肌细胞一般易受外界条件因素的影响存活率往往较低。心肌细胞培养技术已广泛应用于心血管领域分子水平的研究，有助于从细胞和分子水平研究心血管系统疾病的发病机制和治疗方法1，2。本研究的目的在于建立一种简单稳定、可靠的心肌细胞培养方法，以为心血管系统疾病的基础和临床研究奠定基础。1材料和方法1 1材料新生 SD 大鼠由第三军医大学动物实验室提供。小牛血清和 DMEM 培养基(Hyclone 公司)，胰蛋白酶、型胶原酶、青霉素、磷酸盐缓冲液及 5 溴-2 5-溴脱氧核苷尿嘧啶(Brdu，Sigma 公司)，台盼蓝(Gibco 公司)。IX70 型倒置显微镜(Olympas株式会社)。456心 脏 杂 志(Chin Heart J)2013，25(6)DOI:10.13191/j.chj.2013.06.0011 2方法12 1心肌细胞的体外培养1 2 d 的 SD 大鼠，每次取 10 20 只，无菌操作取出心脏并剪成 1 mm3组织块，以磷酸盐缓冲液洗 1 次，弃带血的上清液。用 2.5 g/L 胰蛋白酶和 2.0 g/L 型胶原酶等量混合液在 37 条件下分次消化(每次 10 min)，共 7次，首次消化液弃去。收集细胞悬液，以 1 000 g离心 10 min，吸出上清液，加入含 100 ml/L 小牛血清、100 g/ml 青霉素的 DMEM 培养液，吹打均匀后，经 200 目筛网过滤，于 37、50 ml/L CO2孵箱中差速贴壁 90 min。取上清液，细胞计数以 1 105个/ml 的密度接种于 6 孔板中，加入 0.1 mmol/LBrdu抑制成纤维细胞生长，置 37、50 ml/L CO2孵箱中培养，48 h 后换液首次换液，以后隔天换液，培养 7 d。12 2心肌细胞的形态学观察取培养不同时间的心肌细胞，在倒置显微镜下用光镜观察心肌细胞随着培养时间的不同其形态特征的变化。12 3心肌细胞的纯度鉴定在倒置显微镜下观察并计算差速贴壁纯化后的心肌细胞。心肌细胞的纯度以心肌细胞的阳性率(%)表示，即心肌细胞数/(心肌细胞数+成纤维细胞数)100%。1 2 4心肌细胞的存活率测定取培养第 3 天的心肌细胞悬液和 4 g/L 台盼蓝溶液各 100 l 并混匀。取少量细胞悬液滴在血球计数板，覆上盖玻片，其中呈蓝色的细胞为死亡细胞，未染色的细胞为活细胞。细胞存活率(%)=(总心肌细胞数 蓝染细胞数)/总心肌细胞数 100%。12 5心肌细胞的活力分析心肌细胞培养的第3 天，在倒置显微镜下，6 孔板中每孔任意选取 5 个视野，每个视野任选 10 个细胞，于低倍镜下计数搏动的细胞每分钟搏动次数，计算心肌细胞平均搏动频率。2结果2 1心肌细胞的形态学观察心肌细胞消化后呈圆形，培养 24 h 后基本贴壁生长，可见少数细胞开始搏动，节律不规则，搏动微弱，细胞呈梭形或多角形，核多为 1 个或两个，核仁清楚。培养 48 h 后心肌细胞搏动增强，立体感明显，折光性强。培养 3 d后，细胞伸出伪足交织成网，形成放射状排列的细胞簇(图 1)，呈同步性收缩，搏动细胞百分率约为80%90%。图 1培养 3 d 的心肌细胞(200)2 2心肌细胞的纯度鉴定差速贴壁纯化后，心肌细胞呈圆形，成纤维细胞呈梭形。在高倍镜下任选5 个视野，每个视野计数 1 000 个细胞，计算心肌细胞的阳性率(%)，即其纯度为(91.9 2.2)%(表 1)。表 1心肌细胞纯度的测定视野1000 个细胞中心肌细胞(个)阳性率(%)1935935294894839129124906906589589523心肌细胞的存活率测定任选 5 孔，每孔任选1 个视野，于低倍镜下计数 1 000 个细胞，计算心肌细胞的存活率(%)，即平均存活率(%)为(93.9 2 8)%(表 2)。表 2心肌细胞存活率培养孔1000 个细胞中未染色的细胞(个)存活率(%)1948948295795739159154904904597097024心肌细胞的活力分析心肌细胞培养第 3 天，在倒置显微镜下观察心肌细胞的平均搏动率为 80130 次/min，搏动同步，收缩有力。556心 脏 杂 志(Chin Heart J)2013，25(6)3讨论心脏主要由心肌细胞和成纤维细胞组成，心肌细胞占心脏细胞总数的 33%左右。成功地分离心肌细胞是体外培养的关键步骤，本实验采用2.5 g/L胰蛋白酶和 2.0 g/L 型胶原酶等量混合液，消化时间明显缩短，胰蛋白酶可使细胞间的蛋白质水解，切断细胞间的连接，使细胞脱落，但其也能消化细胞膜上的蛋白成分，心肌细胞比较脆弱，容易被损伤死亡。型胶原酶主要消化细胞间质中的胶原纤维，对心肌细胞损伤小，两者混合使用，既能减少对心肌细胞的损伤作用，又能提供消化效率，缩短消化时间。在常规消化的基础上，本实验进行分次消化，每次消化后，弃上清，加入含 100 ml/L 小牛血清、100g/ml 青霉素的 DMEM 培养液终止消化酶消化，避免酶液对细胞的持续损伤，对心肌细胞具有保护作用。第一管消化液中组织成分较多，应舍弃，可以明显提供心肌细胞的纯度。混合酶消化往往比单一酶消化能获得好的效果，发现胶原酶和 DNA 酶组合使用，能达到很好的消化效果3。在消化过程中，注意控制适宜的温度，在 37酶的活性较高，能获得很好的消化效果。每次消化时间应控制在 10 min 以内，以避免长时间消化酶对细胞的损伤作用。避免产生气泡，因为气泡表面的张力作用可牵拉损伤细胞。用吸管反复吹打，使细胞脱落，可缩短消化时间。心肌细胞和成纤维细胞在培养板中的贴壁速度不同，成纤维细胞比心肌细胞更容易贴壁，采用差速贴壁可纯化心肌细胞，适当延长贴壁时间可提高心肌细胞分离的纯度。本实验将贴壁时间延长至 90min，获得高纯度的心肌细胞，同有关报道相一致4，5。但此种方法只适合短期培养，不适合细胞的长期培养。0.1 mmol/L 的 Brdu 可以抑制成纤维细胞，提高培养的心肌细胞纯度，因其浓度过高会抑制心肌细胞生长。本实验将贴壁时间和加用 Brdu方法适当结合，获得了很好的结果。心肌细胞培养结果受多种因素的影响，一般乳鼠出生时间越短，细胞成活率越高，本实验选择 1 2 d 内的乳鼠心肌细胞培养的成活率很高。培养过程中应严格无菌，尽量缩短操作时间，培养液的 pH值一般应控制在 7.0 7.2 之间，首次换液为 48 h后，以后隔天换液。共换液 6 次，培养 7 天，总之，本实验通过改良后的培养方法，不仅操作简单，而且心肌细胞的纯度和存活率高，较以往方法不同的是，采用两种消化酶协同分次消化，消化完立即终止消化，避免一种消化酶长时间对细胞的损伤作用，培养周期长，可动态观察细胞生长形态变化，是一种较理想的心肌细胞原代培养方法。参考文献:1Shkryl VM，Maxwell JT，Domeier TL，et al efractoriness of sarco-plasmic reticulum Ca2+release determines Ca2+alternans in atrialmyocytesJ Am J Physiol Heart Circ Physiol，2012，302(11):2310 2320 2Marshall GE，ussell JA，Tellez JO，et al emodelling of humanatrial K+currents but not ion channel expression by chronic-blockade J Pfluger Arch，2012，463(4):537 548 3李博，吴慧颖，朴虎林，等 新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良 J 中国实验诊断学，2012，16(2):200 203 4刘嘉祺，孙云云 乳鼠心肌细胞原代培养方法J 微量元素与健康