新生大鼠心肌细胞的原代培养-马芳芳.pdf

康复论著新生大鼠心肌细胞的原代培养作者单位:1.福建医科大学省立临床学院,福建 福州350001;2.福建省心血管病重点实验室马芳芳1,沈晓丽1,林立芳2,韩莉莉2摘要:目的:探讨新生大鼠心肌细胞的分离和培养方法。方法:应用 0.0625%的胰蛋白酶重复消化出生第 2 d 乳鼠的心肌组织多次,收集的细胞用含 10%胎牛血清的 DM EM 培养基中和,用差速贴壁分离法分离,在以溴脱氧尿嘧啶(Brdu)纯化心肌细胞后置 CO2培养箱孵育 7 d。结果:分离 1只乳鼠获得的心肌细胞产量约为 140 万个,且有活力心肌细胞占 90%以上;培养 4 6h 的乳鼠心肌细胞开始贴壁生长,12 24h 明显增殖,3 4 d 后细胞融合成片;心肌细胞由圆形变为梭形、星形、多角形,并出现自发性节律性搏动。结论:本研究应用的心肌细胞原代培养方法可获得高产量、高活力的心肌细胞,是一种可靠的心肌细胞培养方法。关键词:心肌;细胞培养技术;大鼠文章编号:1008-0074(2009)02-0125-04中图分类号:Q95209文献标识码:APrimary culture of neonate rattus cardiocyte/MA Fang-fang,SHEN Xiao-li,LIN Li-fang,HAN Li-li/Chinese Journalof Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2009,18(2):125Abstract:Objective:To explore the primary cultures method of neonatal rat cardiomyocytes.Methods:Cardiac mus-cle of two-day neonate rattus was digested repeatedly by 0.0625%trypsin.The cardiocytes were collected in DMEMmedium,which contains 10%fetal bovine serum.Myocardial cells were isolated with the technique of differential an-choring velocity with 90 min and were pured by Brdu.The cardiocytes were placed into CO2incubator to incubate sev-en days after their purification.Results:A total of 1.4 million cardiocytes can be obtained from one rat and the vitalcell was over 90%;Cardiocytes began to adhere and grow after 4 6 h,to obviously proliferation after 12 24 h,and to converge together after3 4 days.The cardiocytes showed spherical,fusiform and polygon shape in the visualfield of inverted microscope.All cells stretched out parapodium and beated spontaneously and rhythmically.Conclu-sion:A great quantity and high survival rate cardiocytes can be effectively and quickly cultured by this method.Author s address:Fujian Provincial Hospital,Fujian M edical University,Fuzhou,Fujian,350001,ChinaKey words:Myocardium;Cell culture techniques;Rat自 1960 年 Haracy 等 1首次对乳鼠的心肌细胞进行培养以来,国内、外许多学者对心肌细胞原代培养方法进行了研究。体外培养的心肌细胞能够保持其在体内原有的许多结构和功能,同时排除了神经、体液等因素的干扰,因此体外培养在心肌细胞的生长、发育、生理、代谢、病理等研究中具有重要意义。然而心肌细胞在分离过程中易受损伤,活细胞也很少分裂,且不易传代,因此提高心肌细胞产量和活力是许多学者研究的目的。本实验参照Simpson P 等 2心肌细胞的培养方法并作了改进,探讨了乳鼠心肌细胞培养的方法,对心肌细胞形态、搏动状况进行观察,并对其纯度进行了鉴定,从而获得高产量、高活力的心肌细胞。1 资料与方法1.1材料实验动物:选择出生第 2 d 的 SD 乳鼠,雌雄不拘(由福建省医学科学研究所实验动物中心提供)。主要仪器与试剂:二氧化碳培养箱,Olympus 倒置显微镜,超净工作台,低速自动平衡离心机,恒温磁力搅拌器;DMEM 培养基(Hyclonc 公司)、胎牛血清(Hyclonc 公司)、胰蛋白酶(Gibco 公司)、D-Hank s 液(Hyclonc 公司)、溴脱氧尿核苷(Brdu,Sigma 公司)、小鼠抗大鼠Sarcomerie actin单抗(博士德公司);山羊抗小鼠 IgG(博士德公司)。1.2方法1.2.1 心肌细胞的分离:取第 2 d 的 SD 乳鼠,无菌条件下开胸取心尖部,用预冷的 D-Hank s 液洗涤 3 遍,将心脏剪成约 1mm3大小;用 0.0625%的胰酶在 37 恒温磁力搅拌器中消化心肌组织,消化125心血管康复医学杂志 2009 年 4 月第 18卷第 2 期 Chin J Cardiovasc Rehabil Med,Apr 2009,Vol 18 No.2过程中采用分次消化时间(5min 5 次,6min 5次,7min 5 次,8min 5 次),第一次消化后自然沉淀并弃上清,以后自然沉淀后取上清;每次分离的上清液加等量含 10%胎牛血清的 DMEM 培养液轻轻吹打制成细胞悬液,1 000 r/min 离心 10 min,重复 3 次。1.2.2 心肌细胞的培养:细胞悬液放 CO2培养箱培养 90min 后,采用差速贴壁分离技术,吸收培养瓶中的细胞悬液,调整细胞浓度为 5.0105细胞/ml,将单细胞悬液接种于培养板中,前 3 d 滴入 Brdu 使其终浓度为 0.1mmol/L,并继续培养;24h 后换液,以后隔日换液。1.2.3 心肌细胞搏动率的观察:在倒置显微镜下观察第 1 d 至第 7 d 心肌细胞的生长状态、形态变化,并摄像记录自发搏动频率。随机计数培养至第 4 d的心肌细胞的搏动率。细胞搏动率(%)=搏动细胞数/细胞总数 100%。1.2.4 心肌细胞存活率的测定:取相同量的 0.4%台盼蓝液与细胞悬液混匀后再取适量混合液滴于细胞计数板上,随机取 10 个高倍(20)视野计数 4个大格中的细胞总数及未染成蓝色的活细胞数,计数 10 次,取平均值。细胞存活率(%)=活细胞数/细胞总数 100%.1.2.5 心肌细胞纯度的鉴定:取培养 72 h 后心肌细胞进行纯度鉴定,用横纹肌肌动蛋白(a-actin)单克隆抗体作为一抗,用 SABC 法进行免疫细胞化学染色,用磷酸盐缓冲液(PBS)作为一抗的阴性对照。随机取 10 个高倍(20 )视野计数阳性细胞及细胞总数。阳性细胞率=阳性细胞数/细胞总数 100%。2 结 果2.1消化时间对心肌细胞活力和细胞产量的影响实验结果显示,采用 0.0625%胰蛋白酶、37恒温低速磁力搅拌及分次消化时间为 8min 时心肌细胞活力和细胞总数较理想,见图 1,图 2。并且随着总消化时间的延长,细胞活力程下降趋势,见图 3。2.2培养心肌细胞的形态特征培养 4 6 h 后,在倒置显微镜下可观察到心肌细胞开始贴壁生长,初为圆形,后为梭形,偶见单个细胞开始搏动,继而细胞逐渐在瓶壁表面铺展;随后细胞不断分裂、增殖,数量逐渐增多,形成不规则的星形,细胞铺展状况更加明显,并伸出伪足;在培养第 3 4 d,伪足可相互接触交织成网,形成细胞单层或细胞簇,呈放射状排列的同心圆状,其搏动同步化,形成所谓功能性合体细胞,见图 4 图 7(见封三);至第 4 d 自发搏动达高峰,搏动率为 85%90%;至第 7 d 搏动率开始减少。2.3心肌细胞纯度的鉴定横纹肌肌动蛋白(a-actin)单克隆抗体作为一126心血管康复医学杂志2009 年 4 月第 18 卷第 2 期 Chin J Cardiovasc Rehabil Med,Apr 2009,Vol 18 No.2抗,用 SABC 法进行免疫细胞化学染色,可见胞浆呈棕黄色染色;非心肌细胞染色呈阴性。结果显示几乎所有的细胞呈现阳性,说明此时培养的心肌细胞较纯,见图 8(见封三)。3 讨 论心肌细胞培养能提供单个细胞的同源性集落,在可视、可控制的环境中对心肌细胞的特性、药理、病理、生理、代谢和分子生物学等方面进行基础研究,具有产量大,重复性好及不受神经、体液因素影响的特点,已成为心血管研究的基本方法和手段之一,有着广阔的应用前景。由于各实验室所需要解决的问题、实验材料的取舍、实验室具体条件不同等,所采用的细胞培养方法也不尽相同。本研究采用 0.0625%低浓度胰蛋白酶、37恒温低速磁力搅拌及短时间多次消化的方法分离新生大鼠心肌组织,以获得高产量、高活力的心肌细胞。现对新生大鼠心肌细胞体外培养的影响因素进行总结,以提高心肌细胞培养的存活率。消化酶种类的选择:分离心肌细胞通常用的酶有胰蛋白酶和胶原酶 3,也有在胰蛋白酶或胶原酶中加入脱氧核糖核酸酶(DNase)4,目的是防止从损伤细胞中释放的 DNA 积聚。而本实验室通过单独用胰蛋白酶消化得到较高质量的细胞,节省了实验成本。消化酶浓度和消化时间的选择:新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感,因此消化酶的浓度和消化时间是实验成功的关键。不同的实验室采用胰酶的浓度 从 0.05%0.25%不 等,本 实 验 室 采 用0.0625%的胰蛋白酶浓度能获得高产量、高活力的心肌细胞。胰蛋白酶浓度过高时,心肌组织中细胞及间质均受到影响,极易把组织消化成为透明粘稠状液体,使肌原纤维出现萎缩,细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力;胰蛋白酶浓度过低时,心肌组织消化不足,细胞聚集成团,无法分清细胞边界,难以进行形态学观测。不同实验室采用的分次消化时间从 5 8 min 不等,我们在试验中发现分次消化时间为 8 min 时,细胞产量和细胞活力较理想。有的实验室在心肌消化过程中将心肌消化到透明为止,而我们发现随着总消化时间的延长细胞活力呈下降趋势,本实验室将总的消化时间控制在 20min 左右。细胞培养过程中的无菌原则:在进行细胞培养时,组织材料来源、培养液、血清、消化酶、手术器械、培养板等,要严格按无菌实验要求准备,培养过程中具体操作的每一步都应严格遵循实验原则和无菌要求。心肌细胞的观察、拍照时间不可过长,频率不可太高,否则能增加污染概率。心肌细胞生长适宜的 pH 值:心肌细胞生长的最适 pH 值为 7.2 7.4,因此培养液、胰蛋白酶、D-Hank s 液 pH 值均应在此范围内。当 pH 低于6.8 时,对心肌细胞生长会有抑制作用;当 pH 值大于 7.6 时,心肌细胞生长亦会受到抑制,且搏动会减弱。成纤维细胞对心肌细胞培养的影响:细胞培养中的非心肌细胞主要是成纤维细胞,成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力,大量成纤维细胞的存在不仅限制心肌细胞的活动,而且其分泌物也影响心肌细胞的形态结构和生理功能 5。本实验采用 90min 差速贴壁和 Brdu 可得到较纯的心肌细胞。Brdu 可显著抑制心肌细