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动力蛋白的结构与功能 姜灜博 2014301060008 摘要摘要：:在一系列的生物化学反应中，包括纤毛的摆动，细胞分裂以及细胞内的物质运输，动力马达蛋白参与其中，在 ATP 水解供能下，产生力的作用并在微管蛋白上运动。由于动力蛋白的大分子量和高复杂程度，阐释它的作用机理是一项艰巨的任务。然而，通过一系列的途径，包括 X 射线晶体学，冷冻电镜，单分子检验，以及生物化学实验等技术，在理解这些巨大的动力蛋白作用机制方面，我们已经取得了重大的进步。通过这些研究，我们提出了一个动力蛋白运动的机械化学循环(mechanochemical cycle)模型，在这个模型中，ATP 驱动动力蛋白中 AAA+环的弯曲运动，改变了其微管蛋白结合体(microtube-binding stalk)的亲和性，并且使它的机械元素变构，积累能量。关键词关键词 dynein motor protein mechanochemical cycle AAA+superfamily 1 1 动力蛋白的起源 动力蛋白(dynein)是三种细胞骨架马达蛋白中的一种。50 年前，它最初被认为是一种 ATP 酶，并被 Gibbons 和 Rowe 以一种力的单位 dyne 命名。随后，细胞液形式的动力蛋白从脑组织中分离，并显示出驱动向细胞内微管蛋白负极方向运输的功能。动力蛋白的发现正好与驱动蛋白的发现相补充，这种蛋白能向微管蛋白的正极方向移动。我们知道动力蛋白和驱动蛋白(kinesins)都是沿着微管进行移动的，于是我们推测，相比于在肌动蛋白上运动的肌球蛋白，这两种蛋白质的运动机理有着更多的相似性。然而令人惊讶的是，肌球蛋白和驱动蛋白的结构显示，尽管他们在不同的细胞骨架分子上运动，他们都具有 G protein related fold 结构，并且在核心机理上具有一致性i。动力蛋白属于 AAA+总科。和常规的 AAA+ATP 酶相似，动力蛋白含有一个由六个 AAA+模块组成的环状核心，但不同的是，这六个模块是由一条多肽链形成的，同时还有几个独特的附属物(appendage)连接以确保功能。在过去的两年间，动力蛋白的马达结构域的晶体结构被解析出来，并且单分子实验，活细胞成像，以及电子显微镜成像为我们洞察马达蛋白的动力学特征提供了帮助。2 2 动动力力蛋白的分子结构结构 如图所示，a 是动力蛋白重链的线性表示。一个动力蛋白分子包含以下部分：N 端尾部结构域(tail domain)、接头结构域(linker domain)、马达结构域(motor domain)、6 个 AAA+模块、螺旋缠绕的柄状结构(coiled-coil stalk)、尾部(stalk)以及 C 端区域。c 图描绘了动力蛋白马达结构域的结构。马达结构域的 N 端部分形成细长的接头结构域，它在催化区域上部形成拱形，能够传递收缩力。动力蛋白的催化中心包含 6 个 AAA+模块，和同总科形成寡聚体的 AAA+六聚物不同，这 6个 AAA+动力蛋白模块处在同一条多肽链上，并被短的连接序列连接，它们各自具备不同的性质。例如，只有前 4 个模块具有 ATP 结合的功能基元。在接头的另一面，C 端的结构域 AAA5 和 AAA6 相互作用，对环状结构起修饰作用。微管结合结构域位于从 AAA4 伸出的一对反向平行缠绕的螺旋杆状结构的顶端。在它的基部，杆状结构和从 AAA5 中伸出的第二个螺旋尾部相互作用。这样的高度伸展的结构，使得 ATP 的分解和微管蛋白的结合位点相聚 25nm 的距离，能够产生大范围的结构变化。3 3 机械化学循环(mechanochemical(mechanochemical cycle)cycle)动力蛋白功能的核心在于马达结构域的运动。此羧基末端的重链区域可以重组表达为稳定的单体实体，并包含使 ATP 水解转化为运动的所有部件。研究表明，这个过程是包含一个机械周期，其中化学转换(ATP 结合，ATP 水解和无机磷酸 Pi 和 ADP 的释放)和马达结构域的结构变化相关联。相反，结构的变化(如微管结合)反过来可以影响化学转换的速率。虽然某些数据，例如在动力蛋白家族内循环周期各不相同，这可能反应了他们对于特定细胞功能的专一性适应，目前的数据显示，细胞质状态的和轴丝中的动力蛋白的基本作用机制相同。图中表示一个动力蛋白马达结构域的模型。图中的正负号表示微管蛋白的极性。动力蛋白马达结构域朝向微管蛋白的负极移动。在图中，伸长的弹簧表示作用于动力蛋白连接的物体上的力，这并不代表着动力蛋白结构的一部分。连接的这个物体可能代表在细胞液中动力蛋白二聚物中的另一个动力蛋白，或者是轴丝的货物微管蛋白。当没有核苷酸结合在 AAA1 的 ATP 酶结合位点的时候，动力蛋白的马达结构域和微管是紧密结合的。1与 ATP 的结合诱导了动力蛋白与微管蛋白的分离2分离的频率大约 460s1。随后，ATP驱动接头在 AAA+环状结构的上方缓慢的移位（200s1）。3 接头的移位使得与微管蛋白结合结构域延长了其沿着微管的搜索范围。当 ATP 水解成为 ADP 和 Pi 之后，马达结构域和微管蛋白，首先通过弱的相互作用，在一个新的结合位点结合。4与微管蛋白强烈的结合刺激 Pi 从 AAA1 中释放。并且诱导接头回复直形状态，这一步能够产生拉力：，并将力传递给附着的物体。5最后，ADP 从 AAA1 上释放，循环重新开始。动力蛋白中其他 AAA+模块的核酸结合情况仍然未知。在图中，整个循环是以 AAA1 上没有核酸结合的状态开始的，但这并不意味着那是最稳定的状态。实际上，在体内，ATP 的浓度处在 mmol 这一数量级时，一旦 ADP 被释放，ATP 就会立即与 AAA1 结合，因此这个状态只是一个过渡ii。纵观整个机械化学循环，ATP 诱导马达蛋白-微管复合物的离解。从微管分离后，马达蛋白重新排列，为接下来的结构变化(powerstroke)做准备，并完成力的积累。紧接着，在扩散搜索之后，马达和微管蛋白上新的位点的结合，刺激了 ATP 水解产物的释放，触发收缩的力。4 动力蛋白的结构域 4.1 AAA环 AAA+环被认为是动力蛋白的发动机，因为它将 ATP 水解释放的化学能转化为运动。每一个 AAA+模块包括一大一小两个亚结构域，它们被一个柔性的接头连接。为了形成一个环状结构，AAA+模块的一个小的结构域堆叠在相邻模块的大的亚结构域上。正如我们在 AAA+六聚体结构看到的那样，这种布局产生了六个紧密接触的界面(在 AAA+模块之间)，以及 6 个潜在的铰链。在之前的研究的基础上，发生在AAA+模块上的核苷酸交换被认为能够改变铰链的角度，并导致环的弯曲。在 AAA 环中，每一个AAA+模块都包含一个大的亚结构域(由 5 股平行的 片层和侧面的 螺旋组成)，它们与一个小的，主要由 螺旋组成的亚结构域弹性连接。AAA1 的小的亚结构域(AAA1s)堆叠在 AAA2 的大的亚结构域(AAA2L)上，然后 AAA2s 堆叠在 AAA3L 上，以此类推iii，直到 AAA6S 堆叠在 AAA1L 上，整个环闭合。AAA1 是 ATP 酶最重要的位点，并且包含 AAA+总科的特征催化基元。AAA1 具有 Walker.A 和 Walker B 基元，它们各自对于 ATP 的结合和 ATP 的水解起重要作用。在 Walker A 的统计序列(Gly-Lys-Thr)中，Lys 残基(黄色)与 ATP 的磷酸基团作用。如果这个残基突变将削弱了 ATP 的结合能力，并且消除动力蛋白的运动性，并使其与微管蛋白紧密结合。在 Walker B 的序列中(Asp-Glu)，Glu残基(绿色)被认为是催化作用的基础，使水分子极化，对 ATP 的 磷酸基进行内联进攻。如果这个残基发生突变，严重的削弱了 ATP 的水解速率，并消除动力蛋白的运动性。然而，ATP 的结合仍然发生在该突变体蛋白上，使得动力蛋白陷入一个 ATP 结合的状态，并且与微管蛋白结合力很弱。AAA1L 也拥有一个叫 sensor1 的残基(通常是 Asp 或 Thr，图中未表示)参与 ATP 的水解。AAA1s 有一个叫 sensor2 的残基(紫色)，它是一个 Arg 残基，据推测能探测核苷酸口袋的状况，并且调解 AAA+模块的闭合，以及相应核苷酸的结合。此外，一个来自 AAA2L 的 Arg finger 也对于 AAA1的 ATP 酶位点活性起重要作用。和其他 AAA+总科的蛋白质类比，这个 Arg finger 在水解中起到重要的作用。和 AAA1 相比，在动力蛋白环中的其他 AAA+模块和 AAA+总科成员的催化基元的相似程度多种多样。例如，AAA2 缺乏催化基元 Walker B，但是包含 Walker.A 序列，表明它能够结合但是不能水解 ATP。当动力蛋白在无核苷酸的情况下纯化结晶，一个 ATP 分子仍然保持与 AAA2 的结合，进一步表明在这个位点上 ATP 的解离非常慢。4.2 与微管蛋白的周期性结合 Cyclic microtubulebinding 图中是动力蛋白的马达结构域。a 表示弱结合状态的动力蛋白的微管结合结构域的晶体结构 b 表示与微管蛋白二聚物强烈结合的微管蛋白结合结构域的模式图。尽管来源于冷冻电镜(Cyro-EM)的微管结合结构域的原子位置模型不如晶体结构那样确定，我们还是可以清晰的看到，H1 螺旋在与微管蛋白形成强作用界面的过程中，经历了一个大幅度的移位。而 H1的移动使得杆状结构上的 螺旋(CC1 和 CC2)排列相对变化，这样使得微管结合结构域与 AAA+环状结构通过杆状结构相沟通。这种沟通对于动力蛋白的运动是必要的，因为它允许微管结合结构域在一个 ATP 酶周期里，按次序地与微管蛋白结合和释放。在图中 CC1(紫色)和 CC2(橙色)标记，来强调杆状结构中相对位置的变化 c AAA+环状结构和微管结合结构域之间的交流，严重依赖于杆状结构(AAA4 的突出物)和尾部(AAA5 的突出物)。这种杆状物和尾部的相互作用被认为在 ATP 酶循环过程中发生变化。在尾部，四种高度保守的氨基酸残基(Glu3831 Leu3835 Leu3838 和 Leu3846，绿色部分)，以及在杆状 CC2 上的高度保守的三联体(Glu 3570 Arg3573 Trp3574,紫色)或许对于杆状物-尾部界面的结构和动力学十分重要。4.3 接头结构域的变构 Remodelling of the linker 接头结构域结构的变化对于动力蛋白的运动性至关重要。AAA+环状结构分离时接头结构域的电子显微镜影像显示出，接头是一个稳定的结构实体。在 N 端的一个 GFP 插头被标记出来。在 ADP 结合的状态下，接头在 AAA+环状结构上方形成拱形。接头中的 5 个亚结构域被依次编号。在 2 号和3 号亚结构域由一个单独的 螺旋连接，在这之间存在裂缝。在图中被标记出来。除了裂缝外，在拉力的作用下，0 号和 1 号亚结构域之间有潜在的变形可能。当 ATP 或 ADP Pi 结合到 AAA1 上时，接头发生弯曲，在绝大多数情况下会弯向 AAA2，在这个过程中积累了收缩力。此时 PS-1 和 H2 插入接头，用来调节接头的变构。紧接着，随着无机磷酸 Pi 的释放，接头中的收缩力被释放，此时接头位于 AAA4 上面。这时 AAA1 将 ADP 部分包围，并且插入的 PS-1 和 H2 与接头形成一个有限的相互作用。最终，接头停止在 AAA5 的上方，收缩力释放完毕，这一步推测可能使 AAA1 开口并且释放 ADP。AAA3 或者 AAA4 的核心是否能够与接头相互作用，尚且未知。i Vale,R.D&Milligan,R.A.The way things move:looking under the hood of molecular motor proteins Science 288 88-95(2000)ii Imamula,k.,Kon,t.,Ito,K.&Sutoh,