全反式维甲酸和1α-25二羟维生素D3对肝癌细胞HepG2生长的协同抑制作用.pdf

!癌症!#$%&%()*$+,(-.+$/%*#0112#03$40%&567894672!基础研究!东南大学基础医学院病理及病理生理学系分子病理研究所南京04888:!#$%$&$()*(+,-&+./0.$1(+(234,5./$6,$()0.$1(+(23.70.$1(513#%(+(238-1(+()9.#%-:,7%-.+8-%,-,8(&$1,.#$;%2?%.2#&ABBBCDE FE G1%.通讯作者!郑杰!(*%&;($?AB#%C%,#D29039DE070E3DF+G#D29039DEE06DD7HIJ+#,#K#%L%$M36N402O/(J基金项目!教育部留学回国人员科研启动基金$A(O 2D0E885886%!#$%#P/#%$=#-#/Q%&%+*/R()$+=#($-(*=%Q%=)*$%ST%*&%+&!#$%&%P/(,+*&-*(J=%U#$#&=*V(-)/+=#($.#$+$A(O 2D0E885886%收稿日期!0882I85I08修回日期!0882I8EI05全反式维甲酸和!#二羟维生素$%对肝癌细胞&()生长的协同抑制作用卢航青郑杰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摘要&背景与目的!全反式维甲酸%+,I=*+$&*%=#$(#/+/#!WCQW#和5!03二羟维生素XE$5+,;+!03I#V*(GV T#=+J#$XE!5!03%S?#0XE已被证实能诱导肿瘤细胞分化!并用于造血系统肿瘤的治疗!但其对实体瘤的影响研究较少)本研究旨在通过单独和联合使用WCQW和5!03%S?&0XE!观察其对肝癌?%;B0细胞生长和细胞周期的影响!并探讨其相关机制)方法!?%;B0细胞经过不同浓度的WCQW和5!03%S?&0XE单独或联合用药处理后!用UCC法检测细胞抑制率*显微镜观察细胞形态的改变*流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的变化!同时分别用逆转录多!#$C MY K卢航青!等!全反式维甲酸和!#$二羟维生素%&对肝癌细胞()*#生长的协同抑制作用近年来细胞周期调控已成为当前肿瘤学的热点!并出现了癌症可能是一类细胞周期疾病#+(,+-+,(./0(10($%的观点!因为在绝大多数肿瘤细胞中都存在着若干细胞周期调控基因的改变!细胞周期调控基因的改变与肿瘤的发生发展密切相关&(全反式维甲酸#1,234150 4(3/56/+1+/.!7897$是维甲酸类化合物的活性形式!具有抑制细胞生长)促进细胞分化等多种生物学功能!它通过特异性维甲酸受体*4(3/56/+1+/.4(+()364!979$发挥其生物学功能(!#$2二羟维生素%&1,):1!#$2./:-.46;-$#%&是维生素%&的活性形式!其作用方式也是通过其特异性维生素%&受体*$#%&除了能调节体内的钙磷代谢外!对细胞的增殖和分化)免疫功能亦有明显的调节作用!并主要表现在抑制肿瘤细胞的周期进展&#(新近观点认为979和?%9同属类固醇激素核受体超家族!均作用于靶基因上的特定%7序列&!因此7897和!#$*$#%&两者联合使用时可能产生一定的协同作用(本研究以不同浓度的7897和!#$*$#%&对肝癌()*#细胞分别进行单独或联合用药!检测 其 对 肿 瘤 细 胞 生 长 和 细 胞 周 期 负 调 节 基 因)#A7B CDEF和)#GHEF表达的影响!并探讨其作用的分子机制(!材料与方法!主要试剂$II=J 7897和I J!#$*$#%&*K/J=1公司$分别用无水乙醇配成=6,LM和I=6,LM的母液!N#IO避光储存备用!使用时用含$P小牛血清*四季青公司$的9FQE2RSI培养液*/T+6公司$稀释为工作浓度(四甲基偶氮唑蓝*Q88$购自7=(40+6公司+755;/5(?LFE凋亡检测试剂盒购自U(5.(4 Q(.0-03(=0公司+碘化丙啶*FE$)多聚甲醛)84/3652VII等购自K/J=1公司+逆转录FD9试剂盒购自81H191公司(免疫荧光试剂!一抗,鼠抗人)#A7B LDEF单抗!兔抗人)#GHEF单抗+二抗,BE8D标记的马抗鼠EJ*和羊抗兔EJ*!均购自博士德公司(!#细胞培养()*#细胞购自凯基生物公司!常规培养于含IP小牛血清的9FQE2RSI培养液*II WL=,链霉素)II WL=,青霉素$中!培养条件为,&GO!$PD#!湿度IIP!SX:弱光下换液(!$%&法检测收集对数生长期()*#细胞!以#YIS个细胞L孔接种于ZR孔板中*每孔#II,$!待细胞完全贴壁后*约#:$!无血清培养#S:(实验组分别加入含有不同浓度7897和!#$*$#%&的培养液!其中7897组*I=6,LM)=6,LM)I =6,LM$)!#$*$#%&组*5=6,LM)I 5=6,LM)II5=6,LM$及联合用药组&=6,LM 7897I 5=6,CM!#$*$#%&!对照组加入无水乙醇*终体积分数IP$(每个浓度接种$孔!避光培养#)S)R天后进行Q88检测!在酶标仪*QW,3/015 QH&2&$&$上测定SZI 5=处吸光度值*!SZI$!细胞生长抑制率*E9$_*N实验组!SZI值的均值L对照组!SZI值的均值$YIIP(!细胞形态学观察选择对数生长期细胞!无血清培养#S:后!实验 组 分 别 加 入=6,LM 7897)I 5=6,LM!#$*$#%&)=6,LM 7897I 5=6,LM!#$*$#%&!另设无水乙醇*终体积分数I!P$为对照组!避光培养S天后!在相差显微镜下观察各组细胞形态的改变(将各组细胞用I!#$P胰酶消化后!制成聚酶链反应*4($#%&和联合用药的()*#细胞生长均受到抑制!并呈浓度和时间依赖关系!其中联合用药组抑制率明显高于单独用药组*I!I$(经I5=6,L M!#$*$#%&及联合用药诱导G#:的()*#细胞*期细胞占*$S!#Gb&RZ$P和*R$RSb$R$P!与对照组&*SISIbZ$P 相比明显增高*II$!而=6,CM7897组的细胞周期与对照组相比无明显差异*cII$+同时各实验组均有细胞凋亡产生*II$!并以联合用药组最为显著(982FD9显示I 5=6,CM!#$*$#%&和联合用药处理()*#细胞#S:!)#A7B CDEF=97表达与对照组相比分别增高&$P和$RP+BDQ显示两组细胞的F#A7B CDEF和F#GHEF的蛋白表达与对照组相比明显增高*#II$!联合 用 药 组 更 为 显 著!但 经=6,CM 7897诱 导 的 细 胞F#A7B CDEF和F#GHEF的蛋白表达未见明显改变(结论!7897和!#$*$#%&均能够抑制()*#细胞生长!诱导细胞凋亡!#$*$#%&对细胞周期的影响作用是使细胞阻滞在*期!其作用机制可能与其上调F#A7B CDEF和F#GHEF蛋白的表达有关!当与7897联合用药时!能够对()*#细胞生长产生协同抑制作用(关键词!7897+!#$*$#%&+肝肿瘤+()*#细胞+细胞周期+凋亡+)#A7B CDEF+)#GHEF中图分类号!9G&2&R文献标识码!7文章编号!IIINSRGV*#IIR$#NSGINIG!#!C MY K单细胞悬液!收集!#$个细胞!加入#%&()*染液+,!-./0123 45!+#+,6 78(9:;+03后!荧光显微镜下观察细胞核变化%!#流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡!,&,!)*单染法检测细胞周期细胞准备及实验分组同!,?!各组细胞培养6 A后收集!B!+$个细胞!)CD洗涤!缓慢加入(+-冷乙醇!E6+F固定过夜%细胞经)*染液染色后!用流式细胞仪美国C=G123 H0GI03次%!,&,6K33=O03 P8)*双染色法检测细胞凋亡细胞准备及实验分组同!,?!各组细胞培养6 A后收集!B!+$个细胞!按K33=O03 P8)*双染色法试剂盒提供的方法对细胞进行染色标记!用JLQ检测凋亡细胞的百分数!在JLQ双参数散点图上!K33=O03PR8)*E为早期凋