大肠杆菌表达系统-3.pdf

前言前言 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。及所有加工过程。基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物大量蛋白质产物即实现基因的高效表达。即实现基因的高效表达。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。产物。第三章第三章 真核基因在大肠杆菌中的表达真核基因在大肠杆菌中的表达 最佳的基因表达体系：最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高目的基因的表达产量高;表达产物稳定表达产物稳定;生物活性高生物活性高;表达产物容易分离纯化。表达产物容易分离纯化。第一节第一节 基因的表达系统与表达策略基因的表达系统与表达策略 宿主细胞的选择宿主细胞的选择 适合目的基因表达的宿主细胞的要求适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1 1、容易获得较高浓度的细胞；、容易获得较高浓度的细胞；2 2、能利用易得廉价原料；、能利用易得廉价原料；3 3、不致病、不产生内毒素；、不致病、不产生内毒素；4 4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；5 5、容易进行代谢调控；、容易进行代谢调控；6 6、容易进行、容易进行DNADNA重组技术操作；重组技术操作；7 7、产物的产量、产率高，、产物的产量、产率高，8 8、产物容易提取纯化。、产物容易提取纯化。宿主细胞分为两大类：宿主细胞分为两大类：1 1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；等；2 2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。一、真核基因的大肠杆菌表达体系一、真核基因的大肠杆菌表达体系 目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性。肠杆菌表达系统具有明显的优越性。大肠杆菌表达体系的优越性：大肠杆菌表达体系的优越性：1.1.对大肠杆菌的背景知识（完成基因组全测序），特别对大肠杆菌的背景知识（完成基因组全测序），特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解（乳糖操纵是基因表达调控的分子机理有深刻的了解（乳糖操纵子）子）；2.2.是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；主菌株和不同类型的载体；3.3.许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实有效、许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实有效、高水平的表达；高水平的表达；4.4.大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。量生产。大肠杆菌中表达体系的不足：大肠杆菌中表达体系的不足：1.1.真核基因在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。真核基因在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。2.2.真核基因的转录信号同原核的不同。真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的细菌的RNARNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。3.3.真核基因真核基因mRNAmRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因因mRNAmRNA稳定性。稳定性。4.4.许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在；胞中并不存在；5.5.细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。分子，并把它们降解掉。6.6.大肠杆菌周质内存在各种内毒素。大肠杆菌周质内存在各种内毒素。克隆基因正确表达的基本条件克隆基因正确表达的基本条件 能够进行正常的转录和翻译能够进行正常的转录和翻译，以及在以及在正常情况下还与翻译后加工及新生多肽正常情况下还与翻译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关在细胞中的分布有关。启动子启动子、终止子终止子以及正确以及正确读码框读码框（ORF）。二、大肠杆菌的表达载体二、大肠杆菌的表达载体 1、大肠杆菌表达载体的基本成分、大肠杆菌表达载体的基本成分 TTGACA。TATAAT-35 17-10 P R TAAGGAGG（N）8 ATG（91%）GTG（8%）TTG（1%）编码序列编码序列 TAA TGA TAG TT tetr Ori RBS RBS：ribosome binding site,核糖体结合位点核糖体结合位点 SD 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 启动子启动子 终止子终止子 核糖体结合位点核糖体结合位点 密码子密码子 质粒拷贝数质粒拷贝数 寄主生理状态寄主生理状态 转录水平转录水平 翻译水平翻译水平（1）启动子）启动子 要使克隆的外源基因高水平表达的最佳要使克隆的外源基因高水平表达的最佳启动子，必须具备以下几个条件：启动子，必须具备以下几个条件：1）必须是一个强启动子。）必须是一个强启动子。2）这个启动子应能呈现一种低限的基础表达）这个启动子应能呈现一种低限的基础表达水平。使用高度抑制型的启动子是一种极为水平。使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件。（外源蛋白可能对细胞有害）重要的条件。（外源蛋白可能对细胞有害）3）这种启动子应是诱导型的，能通过简单的）这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导，如物理方式使用廉价的诱导物而得以诱导，如物理（如热）和化学（如（如热）和化学（如IPTG）诱导）诱导。（2）转录终止子）转录终止子*当上游启动子驱动的转录作用通读过下游启动子当上游启动子驱动的转录作用通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制。时，便会使该启动子的功能受到抑制。启动子启动子封堵作用封堵作用*在克隆基因编码区的在克隆基因编码区的3-末端接上一个有效的转末端接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读。录终止子，便能够阻止转录通读。此外，转录终止子还能增强此外，转录终止子还能增强mRNA分子的稳定分子的稳定性，从而大大提高蛋白质产物的水平。（避免产性，从而大大提高蛋白质产物的水平。（避免产生多余的二级结构）生多余的二级结构）（3）翻译起始序列）翻译起始序列 mRNA转录本转录本5端的独特的结构特征（核糖端的独特的结构特征（核糖体结合位点），是决定体结合位点），是决定mRNA翻译效率的主要翻译效率的主要因素。因素。至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降低在低在mRNA转录本转录本5-末端形成二级结构的实验方法，末端形成二级结构的实验方法，从而提高克隆的外源基因的表达效率。从而提高克隆的外源基因的表达效率。例如例如:在在RBS序列中增加序列中增加AT含量；含量；诱发特异碱基诱发特异碱基发生定点突变；发生定点突变；以及使用翻译偶联系统进行克隆基以及使用翻译偶联系统进行克隆基因的表达。因的表达。（4）翻译增强子）翻译增强子 大肠杆菌和噬菌体基因中存在一些特殊的序列元大肠杆菌和噬菌体基因中存在一些特殊的序列元件，能够显著地增强异源基因在大肠杆菌细胞中的件，能够显著地增强异源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率。这类特殊序列元件特称为表达效率。这类特殊序列元件特称为翻译增强子翻译增强子。例如：例如：T7噬菌体基因噬菌体基因10的前导序列（的前导序列（g10-L）、）、以大肠杆菌以大肠杆菌atpE基因为代表的一些基因为代表的一些mRNA分子分子5-UTR中的富含中的富含U的区段，以及直接位于的区段，以及直接位于T7基因起基因起始密码子下游的“下游元件”等。始密码子下游的“下游元件”等。分子机制不明。分子机制不明。（5）翻译终止密码）翻译终止密码 对对mRNA翻译终止而言，一个必不可少的条翻译终止而言，一个必不可少的条件是必须存在终止密码子。因此，在构建大肠杆件是必须存在终止密码子。因此，在构建大肠杆菌表达载体时，通常安置上全部的三个终止密码菌表达载体时，通常安置上全部的三个终止密码子，以便阻止发生核糖体的“跳跃”现象。子，以便阻止发生核糖体的“跳跃”现象。已知大肠杆菌格外偏爱使用终止密码已知大肠杆菌格外偏爱使用终止密码UAA，尤其，尤其是当连上一个是当连上一个U而形成而形成UAAU四联核苷酸的情况下，四联核苷酸的情况下，翻译终止的效率进一步提高。翻译终止的效率进一步提高。2、常用的大肠杆菌表达载体、常用的大肠杆菌表达载体 迄今为止，基因工程学家已经设计并构建了迄今为止，基因工程学家已经设计并构建了一系列的以原核启动子取代真核启动子的质粒一系列的以原核启动子取代真核启动子的质粒表达载体系统。表达载体系统。最常用的：最常用的：噬菌体的噬菌体的PL启动子，大肠杆启动子，大肠杆菌的菌的Lac启动子、启动子、Trp启动子，以及启动子，以及pBR322质粒的质粒的-内酰胺酶启动子等一批强启动子构内酰胺酶启动子等一批强启动子构成的。成的。三、大肠杆菌的转化方法三、大肠杆菌的转化方法 1、Cohen转化法转化法 1972年年Cohen改进而成，是目前最常用的方法。改进而成，是目前最常用的方法。操作步骤：操作步骤：（1）将处于对数生长期的新鲜培养物（）将处于对数生长期的新鲜培养物（0.5-0.6 OD)，于，于4,4000转转/分钟离心分钟离心10分钟，回收细菌细胞；分钟，回收细菌细胞；（2）将细胞用）将细胞用0的的0.1mol/L CaCl2溶液重新悬浮细胞沉淀，溶液重新悬浮细胞沉淀，以诱导细胞感受态产生；以诱导细胞感受态产生；（3）加入适量的）加入适量的DNA后，于后，于42 热处理热处理90秒；秒；（4）将混合物快速转移到冰浴中，使细胞冷却）将混合物快速转移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟，分钟，加入适当的培养基在加入适当的培养基在37 培养培养45分钟，使细胞复苏，并表分钟，使细胞复苏，并表达质粒所携带的转化基因；达质粒所携带的转化基因；（5）选择培养基培养，选择转化体。）选择培养基培养，选择转化体。2、Hanahan转化法转化法 1983年由年由Hanahan设计。它的特点是在感受态细胞设计。它的特点是在感受态细胞的诱导方面，除了用的诱导方面，除了用CaCl2和和MnCl2等二价离子按一定等二价离子按一定形式组合方式处理细胞外，还利用二甲亚砜形式组合方式处理细胞外，还利用二甲亚砜（DMSO）、二硫苏糖醇（）、二硫苏糖醇（DTT）和氯化六氨合高钴）和氯化六氨合高钴等进一步处理细胞，其它方面与上法相同。等进一步处理细胞，其它方面与上法相同。这种方法的优点是形成高频率的感受态细胞，可使这种方法的优点是形成高频率的感受态细胞，可使转化效率提高转化效率提高100-1000倍，而且对大小质粒都能进行倍，而且对大小质粒都能进行有效的转化。有效的转化。值得注意的是：值得注意的是：此法要求的条件高，对外界污染此法要求的条件高，对外界污染物极其敏感，对各方面的要求很高。因此，只在极物极其敏感，对各方面的要求很高。因此，只在极少数情况下才使用此法。少数情况下才使用此法。3、电转化法、电转化法 电转化法的转化效率受电场强度、电脉冲的电转化