5种血浆游离DNA提取方法的比较.pdf

中国体视学与图像分析2014 年第 19 卷第 1 期84CHINESE JOUNAL OF STEEOLOGY AND IMAGE ANALYSIS Vol19 No1 March 2014文章编号:1007 1482(2014)01 0084 0090生物医学DOI:10.13505/j.1007-1482.2014.19.01.135 种血浆游离 DNA 提取方法的比较杨麒巍1，杜珍武1，赵冠杰1，于杉1，张琳1，李秀英1，白金萍2，刘颖男1，张桂珍1(1.吉林大学 中日联谊医院中心研究室，长春130033;2吉林大学 基础医学院病理学教研室，长春130021)摘要:目的分别应用 5 种方法进行血浆游离 DNA 的提取，从而判定与筛选最佳的血浆 cfDNA提取方法。方法采集 19 例健康人血浆标本，针对每一样本取 350 l 血浆分别应用经 1 次/2 次酚 氯仿 异戊醇抽提法，经 1 次/2 次酚 氯仿 异戊醇抽提配合微量 DNA 助沉剂法和介孔纳米磁珠法5 种方法进行 cfDNA 提取，应用紫外分光法测定提取 cfDNA 的含量与纯度，应用实时荧光定量 PC 方法以提取血浆 cfDNA 为模板进行扩增反应，以验证提取效果。结果应用 5 种方法从 19例 350 l 血浆样本中提取的血浆 cfDNA 含量分别为(6971.43 1934.40)ng/ml、(2196.86 823.94)ng/ml、(12397.14 4197.37)ng/ml、(5568.29 1618.17)ng/ml 和(7458.57 3706.83)ng/ml，A260/A280 值分别为 0.93 0.07、1.09 0.12、1.15 0.05、1.16 0.12 和 0.89 0.19，T-qPC 扩增成功率为 100%。结论经 1 次酚 氯仿 异戊醇配合微量 DNA 助沉剂法提取量大，纯度高，所提取的血浆 cfDNA 可以为 T-qPC 提供模板，进行后续实验。关键词:血浆游离 DNA;酚 氯仿 异戊醇;DNA 助沉剂;介孔纳米磁;实时荧光定量 PC中图分类号:446.11文献标识码:A收稿日期:2014-12-05基金项 目:吉 林 省 科 技 厅 重 大 项 目(20130727038YY);吉 林 省 科 技 厅 项 目(20100942);吉 林 省 科 技 厅 项 目(20110740);吉林省发改委项目(20101928)作者简介:杨麒巍(1987 )，男(汉族)，吉林省公主岭市人，医学博士。研究方向:分子诊断学。通信作者:张桂珍，教授。E-mail:zhangguizhenjlu163 comComparison of five methods of plasma DNA extractionYANG Qiwei1，DU Zhenwu1，ZHAO Guanjie1，YU Shan1，ZHANG Lin1，LI Xiuying1，BAI Jinping2，LIU Yingnan1，ZHANG Guizhen1(1.Central Laboratory，China Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun 130033，China;2.Department of Pathology，College of Basic Medical Sciences，Jilin University，Changchun 130021，China)2014 年第 19 卷第 1 期杨麒巍等:5 种血浆游离 DNA 提取方法的比较85Abstract:ObjectiveTo screen an optimal method of plasma cell-free DNA(cfDNA)extraction amongfive methods.MethodsPlasma samples were collected from 19 healthy persons.350 l plasma of eachsample was taken to extract the cf DNA by once/twice phenol-chloroform-isoamyl alcohol extraction，once/twice phenol-chloroform-isoamyl alcohol extraction combined with DNA down，and mesoporousnano-beads methods.The concentration and purity of cfDNA was measured by UV spectrophotometry.eal-time quantitative PC(T-qPC)was performed using the plasma cfDNA as a template to deter-mine the extraction efficacy.esultsThe concentrations of plasma cfDNA extracted by the five methodsfrom 19 cases were(6971.43 1934.40)ng/ml，(2196.86 823.94)ng/ml，(12397.14 4197.37)ng/ml，(5568.29 1618.17)ng/ml，and(7458.57 3706.83)ng/ml，and the A260/A280 valueswere 0.93 0.07，1.09 0.12，1.15 0.05，1.16 0.12，0.89 0.19，respectively.The T-qPCamplification success rate was 100%.ConclusionsOnce phenol-chloroform-isoamyl alcohol extractioncombined with DNAdown method can be used to obtain cf DNA in high concentration and purity，and theextracted plasma cf DNA can provide template for T-qPC and subsequent experiments.Key words:plasma cell-free DNA;phenol-chloroform-isoamyl alcohol;DNA down;mesoporousnano-magnetic beads;real-time PC0引言Mandel 等1 在 1948 年首次报道了血浆中游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)的存在，但是由于其含量少，且多为小片段 DNA 分子等特点2，提取较为困难，丢失量大，检验灵敏度较低，限制了其在临床诊断中的应用。本研究分别采用传统的经 1 次/2 次酚 氯仿 异戊醇抽提法、经 1 次/2 次酚 氯仿 异戊醇抽提配合微量 DNA 助沉剂法以及介孔纳米磁珠法提取 cfDNA，并比较各种方法的提取效率，为 cfDNA 的提取提供方法学基础。1材料与方法1.1仪器ABI 7500 实时荧光定量 PC(real-time quantita-tive PC，T-qPC)扩增仪(Applied Biosystems)、Microfuge 22 离心机(Beckman Coulter)、Synergy HT酶标仪(BioTek)。1.2试剂SYB Green Ex Taq(2 )(TaKaa)、OXeference Dye(50 )(TaKaa)、酚 氯仿 异戊醇混合液(25 24 1)(北京天恩泽公司)、微量 DNA助沉剂(北京天恩泽公司)、介孔纳米磁珠(吉林大学化学院赠送)、SDS(上海生工生物工程有限公司)、蛋白酶 K(Sigma)、异丙醇、乙醇(北京化工厂)。1.3引物的设计与合成GAPDH 基因组扩增引物序列如下:上游引物:5-GAAGGTCGGAGTCAACGG-3，下 游 引 物:5-GGAAGATGGTGATGGGATTT-3。由上海生工生物工程有限公司合成。1.4血液样本外周血样品取自19 例健康志愿者，年龄13 73岁，平均年龄 37.0 岁，其中男性 8 例，年龄 13 62岁，平均年龄 32.0 岁，女性 11 例，年龄 17 73 岁，86中国体视学与图像分析2014 年第 19 卷第 1 期平均年龄 42.3 岁。取外周静脉血 4 ml，利用 EDTA作为抗凝剂进行抗凝血处理，于采血后 4 h 内进行实验处理。1.5cfDNA 的提取1.5.1血浆的分离取全血 4 ml，2000 rpm 室温离心 10 min，将上清移至新的离心管中，再经 12 000 rpm 室温离心5 min 后，将上清移至新的离心管中，获得血浆，每例血浆分为 5 份，每份 350 l。直接用于后续实验或20保存。1.5.2血浆经 1 次酚 氯仿 异戊醇抽提法提取 cfDNA3 取血浆 350 l，分别加入 1%SDS 溶液 350 ml、20 mg/ml 蛋白酶 K 溶液 20 l，漩涡震荡混匀，58水浴 75 min。加 入 酚 氯 仿 异 戊 醇 混 合 液700 l，漩 涡 震 荡 混 匀，4 下 12 000 rpm 离 心10 min，将上清移至新的离心管中，加入异丙醇800 l，颠倒混匀，4 下 12 000 rpm 离心 10 min，倾弃上清，加入 75%乙醇 1 ml，颠倒混匀，4 下12 000 rpm 离心 10 min，倾弃上清，65金属浴直至残余液体完全干燥，加入去离子水 10 l，65溶解10 min，20保存。1.5.3血浆经 2 次酚 氯仿 异戊醇抽提法提取 cfDNA在加入酚 氯仿 异戊醇混合液 700 l 并震荡、离心、吸取上清液后，在上清液中再次加入酚 氯仿 异戊醇混合液 400 l，其余步骤同 1.5.2所述。1.5.4血浆经 1 次酚 氯仿 异戊醇抽提配合微量 DNA 助沉剂法提取 cfDNA在加入异丙醇 800 l 的同时加入微量 DNA 助沉剂 5 l，其余步骤同 1.5.2 所述。1.5.5血浆经 2 次酚 氯仿 异戊醇抽提配合微量 DNA 助沉剂法提取 cfDNA在加入异丙醇 800 l 的同时加入微量 DNA 助沉剂 5 l，其余步骤同 1.5.3 所述。1.5.6血浆介孔纳米磁珠法提取 cfDNA4 取血浆 350 l，分别加入介孔纳米磁珠 50 l，4.4 mol/L NaCl 溶 液 40 l 调 节 Na+浓 度 为0.4 mol/L，漩涡震荡混匀，室温吸附 10 min，再次漩涡震荡混匀后立即置于磁力吸附架上，静置 5 s，吸弃液体，加入洗涤液 300 l，漩涡震荡混匀后立即放置于磁力吸附架上，静置 5 s，吸弃液体，重复洗涤 1次，室温开盖干燥 10 min，加入去离子水 100 l，漩涡震荡混匀，65金属浴 10 min，再次漩涡震荡混匀后立即放置于磁力吸附架上，静置 5 s，迅速将上清转移至新的离心管中，20保存。1.6血浆中 cfDNA 的检测1.6.1检测 cfDNA 含量及纯度应用紫外分光光度法进行提取 cfDNA 的含量及纯度(A260/A280)的测定。1.6.2T qPC 检测选取 19 例 DNA 样品，进行 T qPC 反应，反应体系:所提取 cfDNA 模板 100 ng，SYB Green ExTaq(2 )10 l，OX reference dye(50 )0.2 l，上游引物0.5 l，下游引物0.5 l，去离子水补充至 20 l。扩增条件:95 2 min;95 15 s，55 20 s，72 30 s，35 个循环，72 2 min。阴性对照为反应体系中利用去离子水取代 cfDNA 模板，阳性对照为反应体系中