DXY-胰岛的分离与纯化.pdf

前 言 胰岛移植中，保证胰岛供体的数量和质量是胰岛移植成功的关键；从事糖尿病研究的实验也常常需要胰岛细胞。因此，早在 20 世纪 60 年代就已经开始了小动物胰岛分离方法的探索，Hellerstrom 等曾直接从有高血糖的肥胖小鼠分离胰岛用于检测酶活性，后来用同样的方法分离正常小鼠、大鼠和豚鼠的胰岛。由于胰岛散在分布于胰腺的外分泌组织中，并与周围组织紧密连接，胰岛的分离过程实际上是将其从富含消化酶的腺泡中分离出来。所以无论使用何种方法，都会不可避免地引起胰腺外分泌部的破坏、释放的多种酶影响胰岛的数量和质量。因此，胰岛分离是组织细胞分离中最困难的，而提取胰岛的方法存在缺欠、胰腺缺血时间过长、损伤和胰岛的纯化方法等，都是影响胰岛得率的重要因素。其中消化胰腺提取胰岛的过程被认为是至关重要的步骤。不仅各种动物的胰岛分离方法不同，同一动物胚胎与成年的分离方法也不同，稍有偏差就可能导致“颗粒无收”。dongwp 1 写在前面的感谢 经过近两个月的工作，这本电子书终于可以和大家见面了。电子书的完成离不开原帖中战友的精彩发言，特别是dongwp 战友的多次精彩解答，也离不开大家的支持。感谢！电子书制作：libiecao 战友 封面制作：libiecao 战友 零余（非 dxyer，友情赞助）电子书整理：小小东方 电子书校对：dongwp 战友 图片提供：dongwp 战友 morgan1980 战友 abob_ren 战友 jinghuanlv 战友 yangjhdoctor 战友 clsun213 战友 knockout 战友 doctorshi 战友 lilianzhang 战友 AZAFIGHTING 战友 小小东方 2 目 录 目 录 一、大鼠、小鼠、胎鼠及成人胰岛分离纯化的基本步骤.4一、大鼠、小鼠、胎鼠及成人胰岛分离纯化的基本步骤.4 大鼠胰岛细胞分离与纯化（小鼠与大鼠同）.4 胎小鼠胰岛分离.7 成人胰腺消化、胰岛分离方法.7 人胎胰岛冷冻保存方法.8 胰岛鉴定方法.8 胰岛功能检测.9 二、实例分析.11二、实例分析.11 dongwp战友的胰岛单层细胞照片.11 morgan1980 战友的胰岛分离照片.13 yangjhdoctor战友的胰岛分离照片.16 clsun213 战友的胰岛分离照片及解说.19 战友的胰岛分离照片及点评.20 knockout战友的胰岛分离照片及点评(1).21 knockout战友的胰岛分离照片及点评(2).23 knockout战友的胰岛分离照片及点评(3).26 knockout战友的胰岛分离照片及点评(4).28 knockout战友的胰岛分离照片及点评(5).31 doctorshi战友的胰岛分离照片及点评（1）.32 doctorshi战友的胰岛分离照片及点评（2）.36 lilianzhang战友的胰岛分离照片及点评.39 AZAFIGHTING战友的胰岛分离照片.41 三、Q&A.42三、Q&A.42 试剂的选择和配制.42 关于胶原酶.42 DTZ的配置.43 其他.44 胰岛的分离纯化具体实施详解.46 胰腺的分离.46 胰岛的分离和纯化.48 其他.54 胰岛的分离纯化个例答疑.55 经验交流.62 3 一、大鼠、小鼠、胎鼠及成人胰岛分离纯化的基本步骤一、大鼠、小鼠、胎鼠及成人胰岛分离纯化的基本步骤 大鼠胰岛细胞分离与纯化（小鼠与大鼠同）1.成年SD大鼠，810 周龄，体重 250300g，10%戊巴比妥钠 40mg/kg肌肉注射麻醉。2.固定四肢成仰卧位，酒精全身消毒，胸腹部备皮后常规碘酒、酒精消毒，腹部“个”切口，分层进入腹腔，牵开肠管，显露胰管及胆总管。3.1 号丝线于胰管紧靠肠壁处结扎（图 1-1），胆总管内插入 4.5-5 号头皮针，丝线结扎固定，切开胸腔，破心放血处死，经胆总管内插管逆行注入预冷的0.5mg/ml胶原酶p溶液 810ml（视个体大小而定）（图 1-2,1-3），使胰腺膨胀，迅速摘取整个胰腺，移入预置 6ml Hanks液的消化瓶中。6ml Hanks液起到水浴的作用，胶原酶在胰腺内消化，不会被稀释。但在振摇后起到稀释作用，使胰岛在振摇时的被进一步消化受到抑制。注意插管必须在紧贴 12 指肠处进针，因为有分支，如果进针靠前会使部分胰腺得不到灌注。插管后应该可以看到胆汁回流。图图 1-1 结扎胰管结扎胰管 dongwp战友提供战友提供 4 图图 1-2 分离胰腺分离胰腺 abob_ren 战友提供战友提供 图图 1-3 刚灌注好的胰腺刚灌注好的胰腺 abob_ren 战友提供战友提供 5 4.38水浴中静止消化 10 分钟，取出置于冰浴中用眼科镊撕碎胰腺，（消化熟练后可免去此步，直接振摇。此步可了解消化的情况，很容易撕碎的表示已达到消化的要求）。移入消化瓶中振荡 15 秒使其呈细砂状，加入 4小牛血清 10ml与 4Hanks 液 30ml 终止消化。振摇时应该用手腕的力用力振摇后呈细小颗粒（泥沙状）。5.用 600m 不锈钢丝网过滤，细胞悬液用 50ml 离心管 1000 rpm 4离心1-2 分钟，弃去上清液，沉淀物加入 4 Hanks 液洗涤，同样方法离心洗涤，加冷 Hanks 液重悬后均分到 2 根 15ml 离心管内，1000 rpm 4离心 2 分钟，弃去上清液。6.沉淀物加 25%Ficoll 4ml 混匀，其上依次分别加入 23%、20%、11%Ficoll溶液和 Hanks 液各 2ml，3000rpm，4离心 20 分钟，吸出 23%20%及 20%11%界面的胰岛，用 4Hanks 液于 50ml 离心管内离心洗涤 2 次备用。胶原酶P配制：在D-Hanks液中加入 7.5 mmol/L CaCl2、10 mmol/L HEPES、0.2%酚红指示剂，用NaOH调PH值（7.8）后储存。临用时取上述配制好的溶液按 0.5 mg/ml加入胶原酶P，0.22um针头滤器过滤除菌后使用。Ficoll 400 配制：Ficoll配制：称取Ficoll 100g，加 250ml Hanks液（不含CaCl2、NaHCO），待全部溶解后用上述Hanks液定容到 400ml，此为 25%Ficoll；充分混匀后取 92 ml，加上述Hanks液定容到 100ml，此为 23%Ficoll；取 80ml用上述Hanks液定容到100ml，此为 20%Ficoll；取 44ml用上述Hanks液定容到 100ml，此为 11%Ficoll。全部配制完成后高压或煮沸灭菌，4保存。1、Ficoll 100g+Hanks溶液 200ml，完全溶解后加Hanks至 400ml即为 25%Ficoll溶液。2、25%Ficoll 92ml+Hanks 8ml 即为 23%Ficoll溶液。3、25%Ficoll 80ml+Hanks 20ml 即为 20%Ficoll溶液。4、25%Ficoll 44ml+Hanks 56ml 即为 11%Ficoll溶液。附：Hanks 成份剂量表 药物 剂量(g)NaCl 8.0 KCl 0.4 MgSO47H2O 0.1 MgCl26H2O 0.1 Na2HPO42H2O 0.06 KH2PO42H2O 0.06 葡萄糖 0.3 蒸馏水 1000ml CaCl2 1.85 NaHCO3 0.35 D-hanks100ml 液体里，加氯化钙 7.5x110=825mg/L=82.5mg/100ml 6 配方：药物 剂量(g)NaCL 8.0g KCL 0.4g Na2HPO4.12H2O 0.06g KH2PO4 0.06g NaHCO3 0.35g 葡萄糖 0.55g HEPES 2.38g 溶于 800ml 双蒸水中。无水 CaCl2-0.825g，溶于 100ml 双蒸水中。（酚红 1%-4ml，加或不加都可以）1N NaOH 调 pH7.6 定容至 1000ml。PH 值是 7.8 是参考文献的，在使用中不容易掌握，稍过就会产生沉淀，冻存更易发生。后降低到 7.6，发现消化没明显差异，但不会发生沉淀的情况，所以建议用 pH 7.6。胎小鼠胰岛分离 剪碎后加胶原酶（0.5mg/ml），37 度振荡消化 8 分钟，弃上清，加胶原酶，37度振荡消化 8 分钟，吸出细胞悬液，在悬液中加血清和冷 Hanks 液终止消化，沉淀加胶原酶继续 37 度振荡消化 8 分钟，与前次细胞悬液合并，加血清和冷Hanks 液终止消化，1000rpm 2 分钟离心沉淀，Hanks 液洗 2 次，37 度培养。培养的为胰岛样细胞团（ICCs）。成人胰腺消化、胰岛分离方法 成人胰岛分离（29、24、21、11%）是早年用于成人胰岛分离的方法，国外有很多文献报道，Roche 的 Liberase HI 的说明书也介绍用 1.100、1.080、1.060、1.040 分离成人胰岛，其所述的比重接近上述的百分比浓度，由于现在的成人胰岛分离已采用 COBE 2991 细胞淘洗机，故大多用连续密度梯度分离。尸体胰腺原位灌洗后置 UW 液中，4保存运输。到实验室后在 4 Euro-Collins液中清除非胰组织，从胰管内插入穿刺针，丝线缝扎后用注射器灌注 Liberase酶溶液（1.5 mg/ml）。胰腺充分膨胀后将胰腺切片，置消化罐中并放入数颗玻璃珠，加 500m 孔径的不锈钢丝网，旋紧罐盖。开启蠕动泵将剩余的 Liberase酶溶液泵入罐内，控制罐内温度 37，手动振摇消化罐循环消化，于 10 分钟后开始取样镜检，待大部分胰岛分离后用冷的含 10%胎牛血清（FBS）的 RPMI 1640培养液降温稀释终止消化。收集消化物用 10%FBS 1640 离心洗涤，将消化物混悬于 150 ml UW 液中，4冰浴 30 分钟。加载 1.100Ficoll 到 COBE 2991 细胞掏洗机，从 COBE 排除空气，启动 COBE 旋 7 转 2 400 rpm，分别加 1.100 和 1.077 的 Ficoll 到梯度形成仪，将混合形成的连续梯度液泵入 COBE，再泵入含组织 UW 液，最后泵入 Hanks 液，让 COBE 在 2 400 rpm 转 5 分钟后分管收集纯化后的组织，镜检各管，将含有胰岛的各管组织合并，用 10%FBS 1640 离心洗涤两次，取样做胰岛鉴定和计数。人胎胰岛冷冻保存方法 冻存：人胎胰岛加含 10DMSO、20%FBS 的 1640 培养液，4平衡 20 分钟（使DMSO 进入细胞内）用生物降温仪快速降温至 0，保持 20 分钟（促使形成小的冰晶），以 0.3/分降温至80，直接投入液氮内冻存。复温：从液氮中取出后直接投入 40水浴，并轻轻摇动，待溶解后立即移入 50ml离心管中，于冰浴中加等量 Hanks 液，5 分钟后再加 1 倍的 Hanks 液，如此倍比稀释后 1000 rpm 4 离心 5 分钟，加完全培养液重悬再洗一次后培养。胰岛鉴定方法 DTZ 染色检测胰岛的纯度；AOPI 染色检测胰岛的活率。附图 1.胰岛 DTZ 染色(图 1-4)：DTZ 为螯合指示剂，可与铅，铜，锌等螯合，人和动物（豚鼠除外）的胰岛细胞因含锌，DTZ 染色呈猩红色，其它细胞不着色，故 DTZ 对胰岛呈特异性染色。无水乙醇配制：DTZ 10mg 溶于 3ml 无水乙醇(含 50ul 浓 NHOH)，加 Hanks液 12ml，此为储存液，临用时用 Hanks 液（PH7.8）1:100 稀释，0.22u 孔径滤膜过滤，与胰岛制备物混合，室温 10 分钟后，镜检。（染色对细胞无明显影响，可继续培养）DMSO 配制：DTZ 10mg 溶于 10ml DMSO，用 Hanks 液(PH7.8)1:1000 稀释，0.22u 孔径滤膜过滤，与胰岛制备物混合，室温 10 分钟后镜检。2.胰岛 AOPI 染色(图 1-4)：AO 为浸润性染料（膜通透性），可侵入活细胞与双链 DNA 结合发出绿色荧光、与单链 DNA（变性 DNA