2023年核酸抽提经验及原理五篇.docx

核酸抽提经验及原理五篇范文 第一篇：核酸抽提经验及原理核酸抽提经验及原理 核酸抽提经验及原理1：核酸抽提原理简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化那么是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底别离的过程。经典的裂解液几乎都含有去污剂（如sds、tritonx-20230、np-40、tween20等）和盐（如tris、edta、nacl等）。盐的作用，除了提供一个适宜的裂解环境（如tris），还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏（如edta）、维持核酸结构的稳定（如nacl）等。去污剂那么是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能参加蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂（如git、guhcl等）裂解的，该方法已经成为了rna抽提的主流，却不是基因组dna抽提的主流。最常用的纯化方法，一是pc抽提+醇沉淀，二是介质纯化。第一种方法是利用pc对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的别离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的别离。第二种方法那么是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的别离。高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了pc操作的麻烦。当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的pcr。其它杂质–如多糖、多酚等-的去除，根本上都是在这两种方法的根底上，通过增加一些特别的试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。2：了解你的实验样品如果你研究某个实验样品，并且要抽提它的核酸，以下的信息一定要先行收集：该样品的核酸含量、酶含量、特殊杂质含量。如果你对样品的特点一无所知，当样品稍微有一点复杂时，抽提核酸的实验就会碰到许多问题。以血液为例，如果你不知道鸟的血液中有核细胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一样的起始量去抽提鸟血的基因组dna，怎么可能成功。失败了又怎么知道原因所在。同时，只有对实验样品有所了解，才能正确选择裂解方法。绝大局部情况下，使用新鲜样品可以获得最好的结果。对一些杂质含量高的样品，如果使用新鲜样品抽提基因组dna是碰到杂质残留过大的问题，可以试一下-20c保存一天后再抽提的对策，可能会有意想不到的效果。样品如果因为某些原因必须先行保存，也要先简化一下样品：血液最好只保存有核细胞；将样品分割后保存，防止反复冻融。如果实验室不具备适宜的保存条件，将样品先裂解后再保存，是一个不错的选择。3：裂解方法的评价含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组dna的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组dna相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组dna是很容易“缠〞住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，那么不容易被基因组dna“缠〞住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终获得的基因组dna的纯度更高。另外一个思路是，如果基因组dna与蛋白质“缠〞在一起，在纯化的过程中有两种可能：如果基因组dna的特性占优势，那么纯化时以dna的形式被保存下来，导致蛋白质的残留；如果蛋白质的特性占优势，那么纯化时以蛋白质的形式被去除，导致dna的损失。有些样品，如肌肉，即使是rna抽提，也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液（或者在操作中的某个时候使用蛋白酶消化蛋白质），原因在于这些样品中的蛋白质，是非常难以去除的。该方法是获得最大得率和最高纯度的根底。不使用蛋白酶的去污剂裂解方法，仍然在细胞基因组dna抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时。控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用pc抽提的差一些。高浓度蛋白质变性剂（如git、guhcl等）的裂解方法，是抽提rna的首选。总rna的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组dna相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质“缠〞住的问题，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的rna酶，从而确保了rna的完整性。除了极少量不适用该方法的样品–主要是植物，其它绝大局部样品的rna的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为根底的。该方法也可用于基因组dna抽提，非常快速简单，但纯度不是很高。含ctab的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组dna抽提的首选裂解方法。该方法成功与否与两个因素有关：一是ctab的质量，二是洗涤的彻底程度。ctab的质量对裂解效率有很大的影响，而且，似乎还说不清楚原因，因为即使是同一公司生产的纯度一样的ctab，批号不同，效果就可能差异很大。洗涤去除ctab要比其它的盐难一些，同时，ctab的少量残留也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。裂解时的温度，多使用65c；但 如果发现降解严重或者得率太低，可以试一下37c–45c这个相对低温的区域。sds碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组dna污染的特点。控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键。蛋白质的沉淀效率在4c会更好一些，所以，参加溶液iii后在4c静置一段时间以及采用4c离心去蛋白质，都可以提高质量。该方法不一定要使用pc纯化，但结合pc纯化，可以获得纯度很高的质粒。rna的去除可以靠在溶液i中参加rnasea（20230ug/ml）或者在最后的溶解液中参加rnasea（25ug/ml）来实现。总的感觉是，在溶液i中使用rnasea，rna的残留少一些。不过，经典沉淀几乎没有方法彻底去除rna残留。另外，对大质粒（50kb以上），该方法可能会有问题。pcr模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于pcr，非常快速。也正因为不纯化，所以，假阴性（即没有扩增出来的阳性）比例也比较高。该方法最简单的裂解液就是水，复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的pcr反响，而且能提高裂解效率，甚至还可能局部消除样品内抑制pcr反响杂质的东西，如tritonx-20230、甲酰胺等。再复杂一点的就会含有诸如chelex20230之类的能吸附局部杂质的介质。操作也非常简单，多使用温度的变化来实现样品的裂解，如煮沸、或者高温-低温的屡次循环等。该方法最适合从一大堆样品中找出阳性样品，但却不适合用于判断某一个样品是阳性还是阴性。降低样品使用量可以提高阳性率，因为样品量的降低，同时意味着pcr的抑制物量的降低。选择了适宜的裂解液，下一步就是要控制好样品与裂解液的比例。这个问题非常重要，但却没有获得足够的重视。严肃的参考资料，都应该会提供一个简单的比例，如1ml裂解液可以用于tmg组织或者c个细胞；我的建议是，你的样品量绝对要小于资料所提供的。起始样品用多大，并没有具体的说法。如果不是样品量有限，那么以能抽提出满足数次成功实验所需的核酸量，作为决定样品起始量的根底，会比较合理的。不要因为1ml裂解液可以抽提20230mg样品，就一定使用20230mg样品。裂解液的用量，外表上与抽提的结果（纯度及得率）没有关系，然而，在实际操作中，对结果是有比较大的影响的。裂解液的用量原那么是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。另外，裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记。4：纯化方法评价pc抽提/醇沉淀方法，是一个永不过时的方法。稳定、可靠、经济、方便。pc抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品（杂质为蛋白质），该方法完全可以获得高质量的核酸。虽然每次pc抽提都会损失一局部核酸（因为不可能将水相全部移取），以及低浓度核酸的醇沉淀效率低，但这些问题都可以靠操作的调整而得以解决或者减少影响。该方法的最大的问题是不适合大规模抽提。pc抽提是去除蛋白质的一个非常有效的手段。苯酚能使蛋白质变性，变性后的蛋白质从水相中被析出，处于苯酚中或者苯酚/水相之间。pc抽提的关键是，一要混匀彻底，二要用量足够。彻底混匀，才能确保苯酚与蛋白质的充分接触，使蛋白质完全变性。许多人总是担忧混匀的剧烈程度是否会对核酸，尤其是基因组dna造成破坏，实际上大可不必如此小心。剧烈的混匀操作，是会局部打断大分子的基因组dna，但该破坏作用不会强烈到dna变成2023kb以内的小片段。手剧烈晃动混匀后，基因组dna的片段，大局部会大于20kb，这个大小，除了一些特别的要求外，对pcr和酶切，都是完全适用的。如果要求的片段非常大，如构建文库用，那么不能使用剧烈的混匀方法，而只能来回温和颠倒混匀–此时的关键是：裂解液的比例要足够大，使体系不要太粘稠。用量要足够，是因为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的。超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质不会被一次去除，必须靠屡次抽提，方可彻底去除。另外，体系太粘稠的害处是，蛋白质难以彻底去除，以及基因组dna会断裂得更厉害，所以要注意裂解液与样品的比例。4c离心操作有利于更彻底去除蛋白质。pc抽提的另外一个用途是，利用酸性酚可以局部去除dna的特点，在rna抽提时获得dna残留极少的rna。不过有一点要提醒的是，有些植物样品，在去除某些杂质之前，是不能使用pc抽提的，否那么核酸必定降解。高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法。与pc抽提方法相比，除了纯度的稳定性可能要低一点外，该方法几乎克服了pc抽提的所有缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提，缺乏是纯度（蛋白质残留）不够稳定。蛋白质的沉淀效率在4c会更好一些。介质纯化方法，是一个越来越受到重视的方法。其最大特点是非常适合大规模核酸抽提，并且因为受人为操作因素影响小，纯度的稳定性很高（虽然纯度不一定比pc纯化方法更高）。其致命弱点是样品过量。介质可以分为两大类，一类是柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里；另外一类那么是颗粒状（如glassmilk、磁性小珠等）。颗粒状的介质的纯化操作与经典的醇沉淀 差异不大，都是通过数次的加液-倒液过程，枯燥后，溶解即可获得纯化好的核酸。柱式纯化的操作虽然也是有加液-倒液过程，但因为参加的液体通过离心后会进入另外一个离心管中，与含有核酸的柱子完全是分开的，所以洗涤更彻底，操作更省力（不用操心将核酸倒掉了，或者液体的残留）。不过，介质纯化方法的本钱是最高的。5：醇的沉淀醇的沉淀，目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质–主要是盐–的别离。实际操作中，许多杂质也会与核酸一起被醇沉淀下来，尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候。醇的沉淀并不是非常特异性的，任何有机大分子及一些盐，当浓度到达一定水平后，都可能同步被沉淀下来。就核酸而言，标准的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量，但这决不是说这些盐是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。实际操作中不难发现，当裂解体系中核酸的浓度到达一定水平后，即使体系中不含教科书中建议的盐，单独使用醇也可以使核酸沉淀下来；或者含有盐，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下来（当然，得率可能会降低）。知道这一点的意义在于：不要迷信标准方法的唯一性；相反，当使用标准方法碰到问题–主要是纯度问题–时，完全可以通过调整沉淀条件来改善。最有参考价值的是trizol提供的一个沉淀方案：一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留。另外一个问题就是，要坚信核酸的醇沉淀过程同样也是其它杂质的沉淀过程；调整醇沉淀的条件，虽然会降低核酸的得率，但因为可以大大提高纯