2023年两株乙酰甲胺磷降解菌的分离鉴定及降解特性研究.doc

两株乙酰甲胺磷降解菌的别离鉴定及降解特性研究 于彩虹1 张显涛1 宋英男1 张帅1 路兴波2 孙红炜2 x 〔1.中国矿业大学〔北京〕化学与环境工程学院，北京100083； 2. 山东省农业科学院植物保护研究所，山东 济南 250100〕 ：利用富集及驯化培养方法，从长期生产农药的企业废水处理系统及厂房周边的污染土壤和池水中，别离筛选出两株能够高效降解乙酰甲胺磷的菌株Y3、Y6。在形态特征和生理生化鉴定的根底上，对其16S rDNA序列进行了分析，并重点研究了它们对乙酰甲胺磷及其它农药的降解特性和抗性。结果说明，Y3、Y6分别为寡养单胞菌〔Stenotrophomonas〕和假单胞菌〔Pseudomonas〕。Y3、Y6在乙酰甲胺磷浓度分别为500 mg·L-1和1000 mg·L-1，培养温度30℃，初始pH 8.0，接种量为2.5%条件下，一周内可以将80%左右的乙酰甲胺磷矿化为磷酸根。外加葡萄糖及酵母膏对降解效率的研究说明，当酵母膏含量为1g·L-1时，降解效果最理想；而外加葡萄糖的量，会相对抑制农药的降解。抗性实验显示，Y3、Y6均可在较高浓度的其它有机磷类及氨基甲酸酯类农药的普通培养基中生长，对其它农药的抗性也比拟广泛。植物侵染实验显示，Y3、Y6对试验中的豆科、禾本科、十字花科及葫芦科植物不具备致病性，说明Y3、Y6环境安全性较强。 关键词：乙酰甲胺磷；菌株；降解特性 Isolation, identification and degradation characteristics of two acephate-degrading bacteria Yu Caihong Zhang Xiantao1 Song Yingnan1 Lu Xingbo2 Sun Hongwei2 x (1.School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Technology(Beijing), Beijing 100083; 2.Institute of Plant Protection, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100) Abstract: In this study, by the method of enrichment and domestication, we isolated two strains of bacteria designated as Y-3 and Y-6, respectively, from the wastewater treatment system of the pesticide enterprise as well as the soil and water around its workplace. The traditional morphology, physio-biochemical characteristics and 16S rDNA gene sequence analysis were applied to the bacteria classification. The characteristics of degrading acephate and the resistance of any other pesticides were also studied. The results showed that strains Y-3 and Y-6 were identified as Stenotrophomonas sp and Pseudomonas sp. With the initial acephate concentration 500 and 1000 mg·L-1, the initial pH value 8.0, 30℃, the ratio of bacteria suspension (OD600=2)2.5%, the completely degradation rates were both about 80%. The study also demonstrated that the optimum content of the yeast extract was 1g·L-1 , while the content of the glucose inhibits the degradation of acephate. The resistance experiments showed that, Y-3 and Y-6 could also be found in higher concentrations of other types of organic phosphorus and carbamate pesticides in the general growth medium, which have more extensive pesticide resistance. Plant infection experiments showed that, Y-3 and Y-6 almost do not have any pathogenicity on the Leguminosae, Gramineae, Cruciferae and Cucurbitaceae plants, safe to the environment. Key Words: acephate; strain; degradation characteristics 12 乙酰甲胺磷(Acephate)又名高灭磷，化学名称为O,S-二甲基乙酰基硫代磷酰胺酯，是杀虫剂甲胺磷的N-乙酰基衍生物，分子量183.16，结构式为： 乙酰甲胺磷是一种高效、低毒、低残留、持效期长、内吸性强的广谱性有机磷杀虫剂。从2007年1月1日起， 中国已全面禁止在农业生产中使用甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷、磷胺等5种高毒农药， 乙酰甲胺磷作为替代高毒农药的一种主打产品而广泛应用于我国蔬菜、果树和水稻等作物的害虫防治[ 1 ]。2023年乙酰甲胺磷在中国的产量仅有4000吨，近年来起产量逐年剧增，有望成为万吨农药品种[2]。 虽然，人们一直认为乙酰甲胺磷是一种低毒农药，对环境安全性高，被广泛用于粮食、蔬菜和水果生产中，但近年来在中国很多地区的蔬菜、茶叶及海鲜产品的农药残留检测中都发现乙酰甲胺磷的残留超标问题[3,4,5,6,7]，研究说明乙酰甲胺磷在菠菜中代谢较慢，30%的乙酰甲胺磷采用1100ml/hm2的施药量在15天后，仍能够检测到乙酰甲胺磷的残留[8]。乙酰甲胺磷易溶于水，在土壤中易淋溶，易对水体造成污染，在莱州湾海域局部地区能检测到的乙酰甲胺磷含量较高[9]。而且乙酰甲胺磷在植物和动物体内很容易被代谢成毒性更高的甲胺磷。最新的水生物毒理学研究说明，亚致死浓度的乙酰甲胺磷对萼花臂尾轮虫实验种群动态具有显著的影响。随着乙酰甲胺磷在中国的大量生产和使用，相关农药废水的处理、食品和环境中乙酰甲胺磷的残留等问题会越来越突出，并且农药给环境带来的副作用在使用后很长时间才能显现出来。因此，如何降低乙酰甲胺磷的污染和残留问题变得日益重要。 土壤中的有机污染物主要是依靠微生物降解，所以利用生态系统中微生物代谢类型的多样性、生化适应能力的极强性以及能迅速产生相应酶系的应急性，来快速降解各类人工合成的农药，使其完全矿化成无机物，是目前最有潜力最有效的研究方法之一[10,11]。而迄今为止，人们对于乙酰甲胺磷的微生物降解菌的研究较少。因此，别离筛选具有高效降解乙酰甲胺磷农药的微生物，对消除农药污染、净化环境及社会的可持续开展具有重要的现实意义。所以本研究的目的是从农药污水处理池中采样，通过富集和驯化培养，获得以乙酰甲胺磷为唯一碳源的高效代谢菌株，对其进行菌种鉴定，并测定降解特性及致病性。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 培养基〔均加1L蒸馏水，农药适量添加〕 液体富集培养基：牛肉膏3g, 蛋白胨10g, NaCl 5g 液体驯化培养基：NaNO3 1.0g, NaCl 0.5g, K2HPO4 1.5g, KH2PO4 0.5g, (NH4)2SO4 0.5g, MgSO40.5g, 酵母膏0.5g 〔可参加15g琼脂制成驯化平板划线别离〕 降解测定培养基：KNO3 1.0g，(NH4)2SO4 0.5g，KCl 0.5g，酵母粉0.05g 1.1.2 药品与试剂 92%的乙酰甲胺磷原药〔取自山东华阳农药集团〕，其它试剂均为分析纯〔购自北京中北林格生物科技〕。 1.1.3 样品采集 采自山东华阳农药集团厂房周边，以及厂区污水处理系统曝气池曝气泵周围的土样、水样，该厂长期生产有机磷杀虫剂及其它各类农药。 1.2 菌种的富集与驯化 对取到的样品先进行富集培养，起初选择药液的浓度为50mg/L，以周为单位更换培养基并逐步提高农药选择液的浓度〔具体时间以富集效果而定，有时适当延长富集培养的时间〕。当富集培养液中的选择液浓度至少到达500mg/L后，转入驯化培养基培养。配备相应的固体培养基平板，驯化过程涂布观察以及划线别离。将得到的菌株在一般环境下，粗测降解效率较高的两株菌命名为Y3、Y6，作为重点研究对象，并用甘油液封，-20℃保藏。常用待测的菌种置于乙酰甲胺磷为5000mg/L的斜面培养基5℃保藏。 1.3 两株降解细菌的鉴定 1.3.1生理生化特性测定 按照微生物学实验[12]，对筛选到的2株细菌进行革兰氏染色、过氧化氢酶、淀粉水解、尿素反响、硝酸盐复原与糖醇利用等生理生化特性以及温度、pH值适应范围及耐盐性的测定。 1.3.2 16S rDNA扩增、序列测定及同源性比拟 菌株基因组的鉴定采用16S rDNA序列分析的方法。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取Y3,Y6的基因组DNA，以此为模版PCR大量扩增各菌的16S rDNA序列。 PCR扩增正向引物为F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'；反向引物为R：5'-GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。 PCR反响程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火50s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸8min。然后用1%琼脂糖电泳检测PCR产物。 得到的16S rDNA序列扩增产物用DNA回收纯化试剂盒纯化后由上海生工生物工程技术效劳测序。 测得的序列登陆NCBI网站，通过Blast程序与Genbank中核酸数据进行比对分析构建系统发育树。 1.4 乙酰甲胺磷降解量的检测 使用钼蓝比色法[13]，直接测定反响后培养液中磷酸根离子的质量，从而间接确定细菌直接矿化乙酰的量。菌种在降解测定培养基内培养一段时间，取1mL反响后培养液定量稀释参加50mL的容量瓶内，然后参加5ml钼酸铵溶液和3ml抗坏血酸溶液，用水稀释至刻度,摇匀。于室温下放置10min后测定其OD720的值，对照标准工作曲线，求出50mL容量瓶内PO43-的浓度WP，进而求出1mL待测液中彻底降解的乙酰甲胺磷的量，公式如下： 降解的乙酰的量m=(Wp×M Y)/20×Mp 其中Mp—PO43-的分子量，值为95；MY—乙酰甲胺磷的分子量，值为183。 降解率w=(1000×m/m0) ×100% m0—初始参加的乙酰甲胺磷浓度。 1.5 菌母液的制备 将各菌接入液体普通培养基过夜培养，待培养基完全浑浊后以蒸馏水为空白测定吸光度，加适量生理盐水将菌液调至OD600=2.0备用。 1.6 环境条件对菌株降解乙酰甲胺磷的影响 1.6.1 农药浓