2023年蒲公英中绿原酸纤维素酶法提取工艺.doc

蒲公英中绿原酸纤维素酶法提取工艺的优化 ：为了研究纤维素酶法提取蒲公英〔ｔａｒａｘａｃｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ ｈａｎｄ．－ｍａｚｚ〕中绿原酸的工艺，通过单因素试验探讨加酶量、料液比、提取温度、提取时间、ｐｈ对绿原酸提取率的影响，并通过正交试验对影响绿原酸提取率的参数进行优化。结果说明，蒲公英中绿原酸提取的最正确工艺条件为ｐｈ ６．０、加酶量３．０ ｍｌ、提取温度５０ ℃、提取时间１．０ ｈ，此条件下绿原酸提取率为１０．０３１ ｍｇ／ｇ。 关键词：蒲公英〔ｔａｒａｘａｃｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ ｈａｎｄ．－ｍａｚｚ〕；绿原酸；提取工艺 ａｂｓｔｒａｃｔ：ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｄａｎｄｅｌｉｏｎ 〔ｔａｒａｘａｃｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ ｈａｎｄ．－ｍａｚｚ．〕 ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ． ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｄｏｓａｇｅ， ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｓｏｌｖｅｎｔ ｒａｔｉｏ， ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｐｈ ｏｎ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ． ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｐｈ ６．０； ｅｎｚｙｍｅ ｄｏｓａｇｅ， ３．０ ｍｌ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ５０ ℃； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ １．０ ｈ； ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗａｓ １０．０３１ ｍｇ／ｇ． ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｔａｒａｘａｃｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ ｈａｎｄ．－ｍａｚｚ； ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ 蒲公英〔ｔａｒａｘａｃｕｍ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ ｈａｎｄ．－ｍａｚｚ〕别名蒲公草、黄花地丁、黄花三七、婆婆丁等，原产于欧洲，在中国大局部地区均有分布，其味甘苦，性寒，既是营养保健野菜，也是常用的中药材，为药食同源植物之一，是开发绿色天然植物型营养保健品理想的珍贵资源。 蒲公英含碳水化合物、脂肪、蛋白质、多种矿物质、微量元素以及维生素等营养成分，此外还含有蒲公英甾醇、蒲公英苦素、皂苷、胆碱、肌醇、咖啡酸、绿原酸、黄酮类等功能性化学成分，对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性链球菌、卡他球菌均有显著的抑制作用，即具有广谱抑菌作用，此外还具有利胆保肝、抗胃损伤、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫等功能［１，２］。其中的绿原酸是一种多酚类物质，具有重要的生理活性，有抗氧化、抗艾滋病毒、抗致畸、抗过敏、抗肿瘤细胞毒活性、对透明质酸酶和葡萄糖－６－磷酸酶有抑制作用等功能［3］。因此蒲公英及其绿原酸成为功能性食品研究开发的热点，中国国内外已开发出蒲公英饮料、蒲公英酒、咖啡、糕点、糖果以及蒲公英花粉和蒲公英根粉等保健食品。目前，绿原酸提取的原料主要是金银花、杜仲叶，另外有葵粕、稻壳、甘薯、杭白菊、牛蒡叶等［4－１５］，其中蒲公英来源丰富，局部学者用水提或醇提方法进行了蒲公英中绿原酸提取的研究［１６］，而纤维素酶法具有条件温和、没有溶剂残留等优点。 研究采用纤维素酶法提取蒲公英中的绿原酸，用分光光度法测定提取液中绿原酸含量，计算绿原酸提取率，并对影响绿原酸提取率的因素进行了初步探讨，优化了绿原酸提取的工艺，为提高蒲公英的综合利用价值提供参考。 １ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 原料与试剂 蒲公英为２０１１年５月２７日采自山东省烟台市郊区的农田，将其于低温烘干粉碎过４０目筛；３５ ｋｕ／ｇ纤维素酶购自北京梦怡美生物科技，使用前配成5 g/l纤维素酶；绿原酸标准品〔纯度＞９８％〕购自北京中科三捷生物；无水甲醇、无水乙醇、盐酸均为分析纯。 １．１．２ 仪器与设备 ｈｗ·ｙｓ型数显恒温水浴锅购自浙江舟山市定海区海源仪器厂，电子分析天平购自赛多利斯科学仪器〔北京〕，ｔ６新世纪紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器，ｐｈｓ－３ｃ型精密酸度计购自上海精密科学仪器。 １．２ 方法 １．２．１ 纤维素酶法 １〕工艺流程。选材→称量→加去离子水→加酶液→水浴加热→灭酶→用壳聚糖澄清→抽滤→取滤液定容→用分光光度法测定，计算绿原酸提取率。 绿原酸提取率＝提取液中绿原酸质量〔ｍｇ〕／原料用量〔ｇ〕 ２〕单因素试验。酶法提取的效果主要取决于加酶量、提取温度、提取时间、ｐｈ、料液比等因素，选取加酶量、提取温度、提取时间、ｐｈ、料液比作为主要考察因素。①加酶量对绿原酸提取率的影响。准确称取６份１ ｇ蒲公英干粉分别置于6个５０ ｍｌ三角瓶中，分别参加２０ ｍｌ去离子水浸润，然后分别参加０、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０ ｍｌ ５ ｇ／ｌ纤维素酶，摇匀，ｐｈ保持自然状态，密封置于４０ ℃水浴锅中水浴２ ｈ，再置于８０ ℃水浴灭酶２０ ｍｉｎ，取出冷却后参加３ ｍｌ １０ ｇ／ｌ壳聚糖溶液，静置１～２ ｈ，抽滤，将滤液置于５０ ｍｌ容量瓶中用去离子水定容，分别取２００ μｌ至１０ ｍｌ容量瓶中，用体积分数为５０％的甲醇溶液定容，于３２７ ｎｍ处测吸光度，以体积分数为５０％的甲醇溶液作参比，测吸光度，按公式计算绿原酸提取率。②提取温度对绿原酸提取率的影响。准确称取５份１ ｇ蒲公英干粉分别置于5个５０ ｍｌ三角瓶中，分别参加２０ ｍｌ去离子水浸润，然后分别参加最正确体积的５ ｇ／ｌ纤维素酶，ｐｈ保持自然状态，于恒温水浴２ ｈ，水浴温度分别设为３０、４０、５０、６０、７０ ℃，再置于８０ ℃水浴灭酶２０ ｍｉｎ，取出冷却参加３ ｍｌ １０ ｇ／ｌ壳聚糖溶液，静置１～２ ｈ，抽滤，将滤液置于５０ ｍｌ容量瓶中，用去离子水定容，分别取２００ μｌ至１０ ｍｌ容量瓶中，用体积分数为５０％的甲醇溶液定容，于３２７ ｎｍ处测吸光度，用体积分数为５０％的甲醇溶液作参比，测得吸光度，计算绿原酸提取率。③提取时间对绿原酸提取率的影响。加酶量、提取温度通过上述试验确定，提取时间分别设为０．５、１．０、１．５、２．０、２．５ ｈ。其他步骤同②。④ｐｈ对绿原酸提取率的影响。加酶量、提取温度、提取时间通过上述试验来确定，分别设为ｐｈ ４．５、５．０、５．５、６．０、６．５。其他步骤同②。⑤料液比对绿原酸提取率的影响。加酶量、提取温度、提取时间、ｐｈ通过上述试验来确定，料液比分别设为１∶１０、１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０〔ｍ／ｖ，ｇ∶ｍｌ，下同〕。其他步骤同②。 ３〕正交试验。在上述单因素试验结果的根底上进行工艺优化试验。选择加酶量、提取温度、提取时间、ｐｈ进行四因素四水平的ｌ１６〔４５〕正交试验，以绿原酸提取率为评价指标。在最正确工艺条件下进行绿原酸提取试验，３次重复，绿原酸提取率结果取均值。因素与水平见表１。 １．２．２ 绿原酸提取率的测定 最大吸收波长的选择：用电子分析天平精确称取４２．５ ｍｇ绿原酸，用体积分数为５０％的甲醇溶液溶解，并定容于１ ０００ ｍｌ的容量瓶中，摇匀，得到４２．５ μｇ／ｍｌ绿原酸标准溶液。取适量绿原酸标准溶液于2００～5００ ｎｍ范围内扫描，以体积分数为５０％的甲醇溶液作参比。 标准曲线的绘制：精密吸取以上绿原酸标准溶液０、１、２、３、４、５ ｍｌ，分别置于6个１０ ｍｌ容量瓶中，加体积分数为５０％的甲醇溶液定容，摇匀。在３２７ ｎｍ处分别测定不同浓度标准溶液的吸光度，以绿原酸标准样品浓度〔μｇ／ｍｌ〕为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线［１２］。 样品的测定：量取２００ μｌ样品溶液于１０ ｍｌ容量瓶中，置于６０ ℃枯燥箱中挥干，用体积分数为５０％的甲醇溶液定容，以体积分数为５０％的甲醇溶液作参比，于３２７ ｎｍ处测定吸光度，计算绿原酸提取率。 ２ 结果与分析 ２．１ 最大吸收波长确实定 ４２．５ μｇ／mｌ绿原酸标准溶液在３２７ ｎｍ处有最大吸收峰，应选择在３２７ ｎｍ处测定绿原酸溶液的吸光度。 ２．２ 标准曲线及回归方程的建立 标准曲线见图1，绿原酸标准曲线的回归方程为■＝０．２２９ ２ｘ＋０．０２８ ５，相关系数ｒ＝０．９９７ １。结果说明，在0～２１．２５ μｇ／ｍｌ范围内有良好的线性关系。 ２．３ 纤维素酶法提取试验的结果 ２．３．１ 加酶量对绿原酸提取率的影响 由图2可知，不加纤维素酶时绿原酸提取率最低，在加酶量为２．０～３．５ ｍｌ时，随着加酶量的增加绿原酸提取率不断增加；在加酶量大于３．５ ｍｌ时，随着加酶量的增加，绿原酸提取率反而开始下降，因此选择３．５ ｍｌ为最正确的加酶量。 ２．３．２ 提取温度对绿原酸提取率的影响 由图3可知，在提取温度为３０～４０ ℃时，绿原酸提取率随着提取温度升高而升高，在４０ ℃到达最大值，在提取温度为４０～７０ ℃时，绿原酸提取率随着提取温度的升高而降低。原因可能是绿原酸在提取温度比拟高的情况下容易被氧化破坏，所以选择３０～５０ ℃为适宜的提取温度。 ２．３．３ 提取时间对绿原酸提取率的影响 由图4可知，在提取时间为０．５～２．０ ｈ时，绿原酸提取率随着提取时间的增加而升高，在提取时间为２．０ ｈ之后绿原酸提取率开始略有下降，原因可能是在长时间加热情况下，绿原酸结构中的酯键不稳定发生分解，所以，确定提取时间为２．０ ｈ。 ２．３．４ ｐｈ对绿原酸提取率的影响 由图5可知，在ｐｈ ４．５～５．５时，绿原酸提取率随着ｐｈ的升高而升高，当ｐｈ大于５．５以后绿原酸提取率随着ｐｈ的升高而降低，说明酸性条件有利于绿原酸的提取，同时，纤维素酶的最正确ｐｈ刚好在这个区间，此时酶活力最强，这可能与绿原酸呈弱酸性有关，所以，确定为ｐｈ ４．５～６．０。 ２．３．５ 料液比对绿原酸提取率的影响 由图6可知，随着料液比的减小，绿原酸提取率呈现比拟稳定的状态，从本钱考虑，选用１∶２０作为最正确的料液比。 ２．３．６ 正交试验结果与分析 正交试验结果见表２。对正交试验有关数据作极差分析和方差分析，方差分析结果见表３，各因素对绿原酸提取率的影响程度依次为ａ＞ｃ＞ｄ＞ｂ，即在４个影响因素中，ｐｈ、加酶量对绿原酸提取率的影响较大，其次是提取温度，影响最小的是提取时间。以绿原酸提取率为考察指标，４个因素的最优组合是ａ４ｂ１ｃ２ｄ３，即ｐｈ ６.0、加酶量为３．０ ｍｌ、提取温度为５０ ℃、提取时间为１．０ ｈ。在此条件下进行３次重复试验，取均值得到绿原酸提取率为１０．０３１ ｍｇ／ｇ，高于其他组合。方差分析结果说明，ｐｈ对绿原酸提取率的影响到达极显著水平〔ｐ＜０．０１〕；提取时间、加酶量、提取温度的影响不显著。 ３ 小结与讨论 考察了影响纤维素酶法提取蒲公英中绿原酸的主要因素加酶量、提取温度、提取时间和ｐｈ，４个因素的影响程度为ｐｈ＞加酶量＞提取温度＞提取时间。以绿原酸提取率为考察指标，４个因素的最优水平组合是ａ４ｂ１ｃ２ｄ３，即ｐｈ ６.0、加酶量３．０ ｍｌ、提取温度５０ ℃、提取时间１．０ ｈ。在此条件下进行３次重复试验，取均值得到绿原酸提取率为１０．０３１ ｍｇ／ｇ，高于其他组合。 参考文献： ［１］ 李喜凤，郝 哲，杜云锋． 蒲公英的生物活性研究进展［ｊ］．中药材，２００９，３２〔５〕：８２３－８２６． ［２］ 邱清华，邓绍云． 野生蒲公英粗提物对几种植物病原真菌的抑菌活性［ｊ］．湖北农业科学，２００９，４８〔８〕：１８９２－１８９３． ［3］ 郝凤霞，杨敏丽．金银花中绿原酸和黄酮的同时提取别离工艺研究［ｊ］．食品科学