2023年微生物技术在中药炮制中的应用.doc

微生物技术在中药炮制中的应用 [] 中药的发酵炮制是传统中药加工炮制的重要方法，起源于古老的酿酒技术，在我国具有悠久的历史。发酵炮制中药在民间应用极其广泛，对多种疾病具有良好的预防与治疗作用。经自然发酵加工而成的中药品种有六神曲、半夏曲、红曲、淡豆豉、百药煎、片仔癀等。该文对发酵炮制中药的历史起源、主要品种、微生物在炮制中的作用、加工现状以及存在的问题等进行了总结，并对中药发酵炮制的现代化开展进行了展望。 [关键词] 中药；发酵；炮制 [稿件编号] 20231017004 [基金项目] 国家科技支撑方案项目〔2023bai29b02〕；天津市科技支撑方案重点项目〔09zckfsh01100〕 [通信作者] x高文远，教授，e-mail： biochemgao@163 发酵是中药炮制的根本方法之一，在我国具有悠久的历史，早在千余年前，我国已将微生物发酵应用于中药炮制[1]。经净制或处理后的药物，在一定的温度和湿度条件下，利用霉菌等微生物所分泌酶的催化分解作用，使药物发泡、生衣的方法称为发酵炮制[2]。发酵炮制方法，在传统中药的炮制加工中占有非常重要的地位，与其他炮制方法相比，其疗效确切，作用温和，毒副作用少，所加工的制剂被广泛应用于多种中药复方制剂或直接应用于临床疾病的治疗。 1 历史与起源 中药炮制是中医临床用药的一大特色，是传统中医药文化的重要组成局部。炮制，古称“炮炙〞。据说文解字记载，“炮，毛炙肉也〞。可见，早期的炮制主要是用火加工处理药物，从而形成了中药炮制的雏形。黄帝内经中记载了法半夏等的炮制方法，是中药炮制的萌芽。而中药的发酵炮制方法那么起源于我国古老的白酒酿造行业。据考证，早在六七千年前，我们的祖先便创造了使用酒曲酿制白酒的酿酒术[3]。书经·说命篇记载，“假设作酒醴，尔惟曲蘖〞。曲蘖就是最早的酒曲，含有酵母菌和发芽的谷物。早期的曲仅以谷物制成，供造酒之用。后来发现曲有消谷止痢的作用，遂将其作为药物使用。本草经疏云：“古人用曲，即造酒之曲，其气味甘温，性专消导，行脾胃滞气，散脏腑风冷〞。本草纲目云：“古人用麴，多是造酒之麴。后医乃造神麴，专以供药，力更胜之〞。汉晋前后，发酵作为中药炮制手段出现，开展出了以中药做主要原料的药曲。张仲景在金匮要略中记载了神曲的发酵炮制方法。北魏时代的贾思勰在齐民要术中记载了多种制曲方法。在药性论、肘前方、小品方、千金方等中药典籍中都有应用曲类中药的记载。发酵中药作为一种炮制、加工工艺，不但改变了煎、煮、熬、炼、蒸、浸的传统工艺，而且能够更大幅度地提高药效，改变药性，降低其毒副作用。 2 发酵炮制中药的品种 据药性论、本草纲目、韩氏医通、本草蒙筌等史料记载，经发酵炮制而成的传统中药包括两大类。一类是由中药与面粉混合发酵而成的曲类中药，如六神曲、建神曲、半夏曲、采云曲、沉香曲、红曲等，另一类是由中药直接发酵而成的，包括淡豆豉、百药煎、片仔癀、豆黄[4]等。其中曲类中药占了绝大多数，尤其是在明清时期，在半夏曲的根底之上，根据韩氏医通中所述的造曲方法，又制出了皂角曲、竹沥曲、麻油曲、牛胆曲、开郁曲、海粉曲、霞天曲等10余种药曲[5]。据统计，本草文献中所记载的各类发酵中药制品，至今仍在临床中应用的有近20种，而2023年版中国药典中收录的有4种，包括淡豆豉、六神曲、半夏曲和百药煎[6]。这类中药在临床中的应用极为广泛，是许多中成药制剂的组方成分。2023年版中国药典中收录的含发酵类中药的中成药制剂有百余种之多，而部颁标准和各地方标准收载的种类那么更多[7]。曲类中药均具有消食健胃的作用，但由于其药方组成各不相同，其成效与应用也有所区别。目前市售的以半夏为根底的药曲仅有半夏曲与霞天曲2种，其余已很少见临床应用。淡豆豉始载于名医别录，由大豆的成熟种子与青蒿、桑叶一起发酵加工而成，具有解表，除烦，宣发郁热等成效[8-9]。百药煎始载于丹溪心法中，由五倍子、茶叶与酒曲混合发酵而成，具有清热化痰、止血止泻、生津止咳的成效[10]。片仔癀是来自于明代的宫廷秘方，属于国家一级中药保护品种，由田七、麝香、牛黄、蛇胆等名贵中药经微生物发酵制成。主要功能为清热解毒、凉血化瘀、消肿止痛，具有很好的保肝、抗癌、抗炎效果[11]。 3 微生物技术在中药炮制中的作用 中药的发酵炮制过程实际上是一个生物转化的过程，具有选择性强，反响条件温和，转化效率高，副产物少，有效成分破坏少，毒副作用低，下游处理方便等特点。微生物在自身生长代谢过程中产生丰富的胞内胞外酶，如淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、脂肪酶等，能够产生酯化、氧化、葡萄糖基化、异构化、甲基化、乙酰化等多种反响，分解转化原料中特定的底物生成新的活性成分，同时产生丰富的次级代谢产物。通过微生物的生长代谢和生命活动来炮制中药，可以比一般的物理或化学的炮制手段更大幅度地改变药性，提高疗效，降低毒副作用，扩大适应症，产生新的成效，提高有效成分的提取率和吸收利用率。 3.1 产生次级代谢产物 微生物在生长过程中能够产生丰富的次级代谢产物。红曲霉发酵大米制造红曲时产生多种活性成分，包括红曲色素[12-14]、多不饱和脂肪酸[15]、γ-氨基丁酸[16]、麦角甾醇、抗生素、酶类、黄酮、卵磷脂等，其中最重要的是monacolin类物质，这是一类胆固醇合成抑制剂，能有效降低血脂，治疗由高血脂诱发的心脑血管疾病[17-20]，同时还具有抗肿瘤作用[21-22]。六神曲发酵过程中产生的各种消化酶能够促进消化吸收[23]，此外淡豆豉中的大豆经芽孢杆菌发酵后产生的纤溶酶具有溶解纤维蛋白的作用[24]。 3.2 转化原料中的化合物产生新的活性成分 微生物在生长代谢过程中分泌的酶具有广泛的催化能力，能将中药原料中的化学物质分解转化成新的成分，从而使得药物的活性增强。淡豆豉主要由大豆发酵制成，大豆中含有大豆黄素、染料木素等多种异黄酮类成分[25]，大多以结合型的糖苷形式存在，其中含量较高的2种糖苷为染料木苷和大豆苷。经过微生物的转化作用，糖基被脱去，糖苷的含量降低，染料木素和大豆苷元等游离型的苷元含量显著升高[26-27]，极性减小，脂溶性增加，在人体内吸收快，具有更高的活性。研究说明，淡豆豉提取物中含有的异黄酮成分具有明显的抗氧化[28]、抗肿瘤[29]、调节血脂血糖[30]、防治高血压[31]、抗心肌缺血[32]、抗动脉粥样硬化[33]、治疗糖尿病[34]等作用。百药煎在发酵过程中，微生物产生的单宁酶可将原料五倍子中的鞣质转化为没食子酸，从而表现出发酵前所不具备的新的药理活性如抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗过敏、利胆以及支气管扩张作用[35]。单宁酶已在丝状真菌、酵母、细菌、植物和动物体内发现，主要存在于黑曲霉中。关于利用微生物发酵转化中药活性成分的研究报导较多，涉及的主要化学成分包括黄酮类、生物碱、萜类、皂苷类以及多酚类等[36-40]。 3.3 降低毒性 作为一种传统的加工方法，发酵炮制常被应用于降低药物的毒副作用，经过发酵毒性成分被降解或转化为低毒物质。如半夏曲中的半夏为天南星科植物半夏的枯燥块茎，辛温有毒，主要毒性表现为对各种黏膜的刺激作用，可产生呕吐，咽喉肿痛失音等病症，经微生物发酵炮制成曲后其毒性减弱[41]。百药煎的主要成分五倍子中富含鞣质，容易与蛋白质结合形成大分子沉淀物，对胃肠道具有刺激作用。而发酵后形成的大量赖氨酸能够有效防止鞣质与蛋白质的结合，从而缓解服用后食欲减退的副作用，提高其收敛效果[35]。大黄经酵母菌发酵后，总蒽醌与结合型含量降低，游离型蒽醌含量增加，缓和了对胃肠道的刺激，降低了泻下作用[42]。喜树碱具有较强的抗肿瘤活性，但其在喜树中的含量仅为0.002%，提取别离费时、费力，同时又具有严重的胃肠毒性，如抑制骨髓功能和引起出血性膀胱炎等，制约了其临床的进一步应用。通过微生物发酵将喜树碱转化为其结构类似物10-羟基喜树碱后，其对多种癌症亦具有显著的疗效，且毒副作用降低[40]。此外还有许多毒性中药，如马钱子、三七、雷公藤、何首乌等，通过微生物的转化作用都得到了较好的减毒效果[43]。 3.4 增加疗效 比照生半夏、制半夏及半夏曲的成效发现，半夏只有经发酵成曲后，才具有健脾温胃消食的成效，原有的燥湿化痰功能也有所增强[44]。胡昌江等[45]用小白鼠氨水引咳、酚红祛痰、二甲苯耳廓肿胀，大白鼠皮下塑料环肉芽肿增生等方法比拟了改进百药煎发酵前后的镇咳、祛痰、抗炎作用，结合体外抗菌试验，结果说明改进百药煎发酵后有更强的镇咳、祛痰、抗炎、抗菌作用。采用麻黄、莱菔子、金银花、连翘等中药材对灵芝菌进行液态发酵，其祛痰止咳效果更强[46]。郭芳等通过碳粒廓清试验、二硝基氟苯法和血清溶血素法等研究六味地黄对小鼠的免疫调节作用，发现其发酵液的活性明显优于煎剂[47]。 3.5 破坏细胞壁结构 植物细胞坚硬致密的细胞壁结构是阻碍药用植物有效成分从胞内溶出，以及体内吸收的屏障。而微生物所分泌的各种胞外酶可有效地分解植物细胞壁中的纤维素、半纤维素、果胶、木质素等成分，从而破坏细胞壁结构，增加细胞间隙，为细胞内外的物质扩散提供传质通道，提高有效成分的提取率与吸收利用率。研究说明，经过微生物发酵后盾叶薯蓣中有效成分薯蓣皂苷元的产率明显提高[48]。 4 发酵炮制工艺研究概况 传统的发酵炮制类中药几乎都是根据前人的经验，在自然发酵条件下进行的，其中绝大局部工艺至今尚在沿用。传统的炮制加工方式生产效率低下，产品质量与药物疗效不稳定，与中药现代化国际化的开展趋势及日益增长的消费需求极不相衬，因此对传统炮制工艺的改革势在必行。目前对于发酵炮制类中药的工艺研究主要涉及以下几个方面。 一是发酵菌种的别离、筛选与鉴定。不同的微生物菌种产次生代谢产物的产量与能力有着极大的差异，它们的菌种特征、发酵效果也各不相同，不同菌种产生monacolin k的能力有很大差异。因此高产率、高转化率、低毒性的发酵菌种的获得是中药发酵炮制的关键因素。红曲菌能够产生monacolin类物质、红曲色素、γ-氨基丁酸等多种活性成分，然而其发酵过程也常常伴随着真菌毒素橘霉素的产生。因此优良发酵菌种的筛选主要侧重于高产目标产物，低产毒素的菌种[49-50]，以及同时产多种活性产物的菌种[51]，此外产单一品种红曲色素菌种的获得可以极大地简化从多种色素中别离提取单一色素的步骤[52]。 鉴于目前多数发酵炮制类中药采取的是自然发酵方法，参与发酵的微生物种类不甚明确，对于发酵过程中的优势菌种的研究有利于说明发酵炮制机制，优化发酵工艺。韩小敏等报道百药煎的发酵主导菌为黑曲霉[53]，汤扬等对贵州淡豆豉进行了菌种别离鉴定，从中别离到的菌种主要为芽孢杆菌，另有少量肠杆菌和假单孢菌等污染菌[54]。不同产地和加工工艺制作的神曲样品中所含的微生物差异较大。胡静等从多个神曲样本中别离出大量酵母菌和少量乳酸菌[55]。高慧从自然发酵的神曲中别离出了枯草芽孢杆菌、毛霉和曲霉[56]。而福建范志神曲的主导发酵菌种为梨头霉[57]。芦艳卿等从六神曲中别离出的霉菌分属青霉属的分枝青霉组、曲霉属的烟曲霉组和巢曲霉组、毛霉属的总状毛霉组[58]。 二是发酵工艺条件的优化。微生物的营养条件与培养环境对其生长与代谢产物的积累具有极大的影响。药物原材料不仅为菌种提供生长所需的营养成分，而且为后续的微生物转化作用提供底物。因此，药物原料配方的组成、配比、预处理方式等都会对最终的药效产生极大的影响。通过改变料曲切块与发酵的先后顺序、向药料中参加已发酵好的曲料、以麦麸代替面粉作主料、向基质中通入流通蒸汽灭菌[59]等方法，能够缩短发酵周期，减少原料本钱，提高产品卫生质量，解决真菌毒素污染问题。研究说明[60]，在厌氧条件下，红曲红色素与橘霉素的形成与初级代谢产物类似，与菌体的生成相关；而在好氧条件下，橘霉素的生成与次级代谢产物一致，主要在稳定期形成，因此对