微流控细胞学应用.ppt

1 汇报人：李军 时 间：2016.11.01 微流控芯片上基于免疫磁珠细胞分选及基于水凝胶微阵列药物作用分析 目 录 一、研究背景 二、基于免疫磁珠细胞分选 三、基于水凝胶微阵列药物作用分析 四、结果与讨论 常规的细胞研究方法存在以下几个难点：细胞的尺寸微小,难于操纵 细胞内成份复杂且含量微小,并包含有大量的生物学信息,需要高通量的分析和高灵敏度的检测手段 传统的细胞培养方法无法提供复杂、微尺度的生长环境。一、研究背景 微流控芯片细胞学研究优点：通道尺寸（10100微米）与单个细胞直径（1020微米）相近，便与操控 多维网络结构更接近生理状态下细胞的生存环境 可满足高通量细胞分析需要，可同时获取大量生物学信息 多操作单元灵活组合，进样，培养，捕获，裂解，分离检测集成于一块儿芯片上 平板几何构型，方便观察 传热传质快 一、研究背景 一、研究背景 HIV进入人体后会特异性的攻击破坏阳性淋巴细胞并进行大量复制和繁殖,引起淋巴细胞数量的减少,导致人体免疫功能不断下降并潜伏几年之后因各种机会性感染而发病。因此,临床上将旷淋巴细胞的数量作为监测疾病进展以及评估临床治疗疗效的重要指标,当每微升体液中淋巴细胞绝对数量小于200个时被认为患有艾滋病。二、基于免疫磁珠细胞分选 磁活性激活细胞分选磁活性激活细胞分选利用抗原抗体的免疫反应捕获全血中的淋巴细胞,包被有抗体的磁珠具有高的比表面积,并且能在外加磁场或电场的作用下对磁珠进行操纵。在微流控芯片上,利用磁性微珠进行细胞分选法与在微通道表面修饰抗体进行细胞分选的方法相比,细胞捕获效率有了很大的提高 二、基于免疫磁珠细胞分选 二、基于免疫磁珠细胞分选 二、基于免疫磁珠细胞分选 以PDMS为材料的聚合物微流控芯片与其它硬性材料的操作系统相比:更易于集成化,具有良好的生物相容性,对气体有一定的通透性,有利于细胞培养过程中气体交换 能方便制作多层微流控系统 但是微流控芯片也有一些不容忽视的缺点,如:形成的微结构不如硬性材料稳定 对一些非极性小分子具有吸附作用,同时还具有较强的疏水作用 二、基于免疫磁珠细胞分选 细胞样品的制备细胞样品的制备实验中所使用的淋巴细胞悬液从小鼠的胸腺组织中提取。无菌的条件下从小鼠中分离出胸腺组织,清洗,置于无菌玻璃器皿中,用手术剪刀将其剪成小碎片,过滤得到细胞悬液,离心以除去死细胞和细胞残骸,然后重悬于pH为7.4的PBS中。用血球计数板对细胞悬液的浓度进行计数,细胞的存活率用的台盼蓝进行测试。为了保持细胞的良好活力,从小鼠胸腺中提取出来的细胞悬液在24小时之内使用 二、基于免疫磁珠细胞分选 二、基于免疫磁珠细胞分选 反应室中液体的流速减小,可以增加包被在磁珠表面上的抗体与细胞表面抗原之间的免疫反应时间,从而提高细胞捕获效率。通过设计截面积较大的反应室,并利用分散均匀的免疫磁珠对目标细胞进行捕获能达到比较高的细胞捕获效率。细胞的进样流速比较小时,细胞可能会由于自身的重力沉降在微通道内,而未能进入到反应室中与免疫磁珠结合,捕获效率比较低。流速过快,细胞来不及与反应室内的免疫磁珠结合,从而极大地减小了细胞的捕获效率。三、基于水凝胶微阵列药物作用分析 光引发聚合水凝胶可作为细胞固定的一个非常理想的材料,因为它具有:较高的含水量,柔软,并且能够进行物质传递。光引发聚合水凝胶的预聚物,可以将细胞固定在水凝胶微结构中。细胞还可以被选择性地固定,并且水凝胶微结构的形状可以通过光掩膜上绘制的图形来控制。由于水凝胶微结构的网孔大小为110nm左右,对固定在水凝胶微结构中的细胞进行培养时便于营养物质和氧气的输送。三、基于水凝胶微阵列药物作用分析 三、基于水凝胶微阵列药物作用分析 本研究利用人肝癌HepG2细胞和人肺上皮A549细胞为模型进行药物筛选分析。由于水凝胶聚合的过程中预聚物的组成和光照聚合的条件对细胞的活性有影响,通过实验对这两个参数进行考察优化。然后用抗癌药对水凝胶包裹的两种肿瘤细胞进行药物刺激,并用两种荧光探针2,3-萘二甲醛,和二氢乙锭分别对细胞内的谷胧甘肤,和活性氧自由基舒,进行了定量检测。通过与孔板上的对照实验相比较,证实了利用水凝胶固定细胞用于药物筛选分析,具有简单、可靠和高通量的分析能力。三、基于水凝胶微阵列药物作用分析 研究中,我们利用荧光显微镜控制紫外光的方法,能非常方便的在微通道中加工出水凝胶微结构,并且水凝胶微结构的形貌和位置都可控。通过对水凝胶加工过程中紫外曝光时间、聚合物单体和引发剂浓度的控制,能使细胞的存活率保持在大约。对包裹的细胞进行长时间的培养,细胞也能保持良好的生理活性。这说明这一操控技术能够应用于细胞生物学以及分子生物学的分析。这些操作对仪器设备的要求低,在普通的化学或生物学实验室都能实现。通过控制水凝胶微结构的尺寸与细胞尺寸相近,还可以在微通道中实现大量单细胞的固定。将细胞包裹在水凝胶微结构中,在一定程度上能保护细胞避免经受大的剪切力的损伤,同时还能对固定在预定位置的细胞进行长时间的监测和分析。在微流控芯片上巧妙设计含有截面积扩大反应室的型微通道用于分离和捕获淋巴细胞。根据流体力学基本原理,在连续的流体中,由于截面积不同导致流速有差异。在截面积较大的反应室内液体的流速小有利于细胞的捕获。在实验中,利用外加磁铁将包被有抗体的磁珠捕获在反应室内,通过磁珠表面的抗体与细胞表面的抗原之间的免疫反应将目标细胞捕获,其捕获效率能达到90%左右,成本低廉,检测快速等特点,并且只需要普通的显微镜即可完成检测,能应用于资源匾乏地区的艾滋病检测。可以在微通道中的不同位置同时设计多个反应室来分选不同的细胞,例如同时分选不同的肿瘤细胞,在疾病的早期诊断中具有潜在的应用价值。将光刻技术与微流控芯片相结合,使用荧光显微镜控制紫外光照射的区域和位置,实现微通道内形状和位置可控的水凝胶加工方法,将细胞包裹在水凝胶微结构中,并研究了抗癌药物对水凝胶包裹细胞的毒性影响。此外,这种简便的水凝胶加工方法还能用来固定蛋白质、等生物分子并能保持它们的活性,从而能应用于各种生化研究中。四、结果与讨论 谢 谢