DB23T 3168—2022 盐碱土壤嗜盐细菌与古菌资源分离与快速分类技术规程.pdf

DB23/T3168-20226.4土壤pH和水溶性盐总量的测定土壤pH和水溶性盐总量的测定分别按照NT/T1377和NT/T1121.16的规定进行。6.5菌悬液的加样及培养6.3中的土壤悬浮液按照NY/T2321-2013中5.1.4.3的要求涂布在制备好的培养基平板上，在3035恒温静置培养箱中倒置培养。培养极端嗜盐古菌的平板需要放在大封口袋中，并在袋中放置盛一定量水的烧杯，培养时间7d10d。6.6纯菌株的获得及耐盐性的判断采用平板反复划线分离法获得纯菌株。挑取6.5中含有不同盐浓度的平板上长出的单菌落划线至新的、且具有同样盐浓度的平板上（确保每次划线都能有单菌落出现，且每次都挑取单菌落转移至下一个新平板)，反复操作三次以上，直至在同一平板上长出的菌落大小、形状、颜色、质地、光泽等特征一致，则该菌株为可耐受该盐度的纯菌株。6.7注意事项分离古菌时的注意事项如下：a)分离古菌的培养基中不能含Difco Bacto-Peptone蛋白胨：b)分离古菌的培养基中琼脂要先清洗后再加入，具体的方法是：称取16.5g琼脂至蒸馏水中，搅拌5min,放置30min静置沉降琼脂，吸去上清，重复洗涤直到上清液变澄清，然后加水至50mL,再搅拌加入培养液中：)高盐浓度下琼脂容易沉积，而且比普通的培养基更不容易去除气泡，分离古菌的培养基应在灭菌后的较高温度下将琼脂缓慢摇匀再倒平板。7分类方法7.1工具小型离心机，微量可调移液器(2.5L、10L、1004L、1000L)及对应的无菌Tip头，细菌基因组DNA提取试剂盒，超净工作台，PCR仪，电泳仪及电泳槽，凝胶成像分析系统。7.2模板DNA的提取及其浓度测定微生物基因组DNA的提取、纯化及其浓度测定按照、Y/T2066-2011中5.4和GB/T19495.3的要求进行。7.3引物的选择细菌16SrNA通用引物27F:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3:1492R:5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3.古菌16 S rRNA通用引物21F:5-ATTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3:1540R:5-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-37.4PCR反应以同一待测菌株的DNA为模板，分别用细菌引物和古菌引物扩增，扩增出目标片段，且片段大小在1.5kb1.6kb的为目标菌。反应体系和反应参数按附录B中的B.1和B.2的规定进行，PCR反应的质量控制按照NY/T2006-2011中5.2规定的方法进行。3