2023年饲料发酵工艺对益生菌增殖及大肠杆菌数量变化的影响.doc

饲料发酵工艺对益生菌增殖及大肠杆菌数量变化的影响 摘 要：以植物乳杆菌和大肠杆菌 E.colik88 为指示菌株，研究了饲料的液态转固态发酵与固态发酵两种工艺在 20 ℃与 30 ℃两种温度下的 pH 值变化及菌数的动态变化。结果说明：①30 ℃温度下，物料的酸度变化〔pH 值〕比 20 ℃温度时下降的速度快、幅度大；②在固态发酵过程中，液态转固态发酵的起始 pH 值低于固态发酵〔P＜0.05〕，但液态转固态发酵和固态发酵在发酵过程中 pH 值差异不显著(P＞0.05)；③在 30 ℃的发酵温度下，乳酸细菌数呈先增值后下降趋势，但液态转固态发酵与固态发酵之间差异不显著(P＞0.05)；④在液态转固态发酵工艺下，大肠杆菌 E.colik88 菌数呈直线下降趋势，而在固态发酵工艺下，大肠杆菌 E.colik88 菌数呈先升后降，证实液态转固态工艺对原料中大肠杆菌直接产生抑菌作用。 关键词：益生菌；发酵工艺；乳酸菌数；抑菌特性 随着饲料中抗生素类生长促进剂在欧盟的全面 禁用，饲料微生物发酵技术在动物生产中受到高度重 视，欧盟已实现广泛应用。饲喂微生物发酵饲料有提 高动物生长性能和改善肠道健康的作用〔Scholten 等， 1999；Canibe 等 2023〕，荷兰至少有 50％的猪在饲喂 发酵饲料，丹麦有 30％以上的母猪饲喂发酵饲料，母 猪泌乳期的使用更达 70%以上。另外，法国、瑞典、西 班牙也陆续开始使用微生物发酵饲料。饲料发酵目前 主要采用液态发酵和固态发酵两种工艺，液态发酵 〔Submerged Fermentation,SmF〕具有周期短、易控制、 微生物的繁殖重复性强等优点，但需要配套昂贵的系 统设备，难以被群众所接受；固态发酵〔Solid State Fermentation,SSF〕具有培养基简单，基料来源广泛；投 资少，能耗低，操作方便等优点，但劳动强度大，难以 与现实规模化养殖生产所需的系列化日粮配合加工 结合。为此，本课题设计饲料液态发酵转固态发酵新 工艺并展开了系列研究。试验以植物乳杆菌〔Lacto－ bacillus plantarum〕 和致病性大肠杆菌 E.colik88 为指 示菌株，研究在液态转固态发酵饲料中目标益生菌和 指示菌的动态变化情况，为建立适合我国养殖生产条 件的生物发酵饲料新工艺提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 菌株来源 植物乳杆菌由湖北省农业科学院畜牧兽医研究 所别离、鉴定并保存；大肠杆菌 E.colik88 购于中国兽 医药品监察所。 1.1.2 培养基选择及菌株培养 参照何涛等介绍的方法，植物乳杆菌采用 MRS 培养基，大肠杆菌 E.colik88 采用伊红美兰培养基培养。 1.1.3 主要仪器设备 超净工作台〔苏州安泰 SW-CJ-1CU 型〕、酸度计 (上海理达 PHS-25C 型)、高压蒸汽灭菌锅〔上海申安 ZDX-35BI 型〕、恒温培养箱 〔黄石恒丰 SP-01 型〕、 微型发酵瓶(罐头瓶)。 1.1.4 发酵基料设计原那么 以生长后期仔猪配合饲料为发酵的根底原料，即 不含预混料的配合饲料〔配方见表 1〕。在此根底上， 制备如下三种发酵基料，①固态发酵基料：为不含微 量元素、维生素、矿物质的配合饲料；②液态发酵基 料：玉米、豆粕按质量分数 1： 3 混合均匀；③液态转 固态发酵基料：为固态发酵基料中减去液态发酵基料 的局部。 饲料工业·2023 年第 32 卷第 5 期 试 验 研 究 30表 1 固态发酵基料配方 原料名称 玉米 豆粕 鱼粉 麸皮 膨化大豆 比例〔%〕 66 18 3 5 8 1.2 试验方法 1.2.1 试验设计与方案 采用 2 因子试验设计。研究了2 种发酵温度〔20 ℃， T1；30 ℃，T2〕下，不同发酵工艺〔液态转固态发酵和固 态发酵〕对 pH 值及菌落数的影响，设计方案见表 2。 表 2 设计方案 发酵温度 T1〔20℃〕 T2〔30℃〕 发酵工艺 液态转固态发酵 固态发酵 液态转固态发酵 固态发酵 1.2.2 试验操作方法 1.2.2.1 液态转固态发酵工艺操作方法 第一阶段〔液态发酵〕：称取 20 g 液态发酵基料 于微型发酵瓶中，以料水比 1： 3.5 参加 70 g 水，按 10 6 cfu/g 物料接入植物乳杆菌，在 25 ℃的恒温条件下 静置培养 48 h。 第二阶段〔固态发酵〕：直接在液态发酵料中参加 80 g 的固态配合料，搅拌均匀，使终水分在 40%左右。 并按每 10 6 cfu/g 物料接种 E.colik88，密封置恒温培养 箱中培养。 1.2.2.2 固态发酵工艺操作方法 与液态转固态发酵工艺的第二个阶段同时进行， 具体操作如下：称取 20 g 液态发酵基料和 80 g 的固 态配合料于微型发酵瓶中，参加一定质量的水，使终 水分在 40%左右，按 10 6 cfu/g 物料分别接种植物乳杆 菌和 E.colik88，搅拌均匀，密封置恒温培养箱中培养。 1.2.3 指标测定 分别于固态发酵开始后第 0、24、48、72、120、168 h 无菌取样，进行 pH 值和微生物的测定。 pH 值测定：取鲜样 10 g，用 100 ml 蒸馏水浸提 1~ 2 min 后，经纱布过滤，水浸液当即用酸度计测定 pH值。 微生物测定采用 10 倍稀释法，植物乳杆菌测定 应用 MRS 琼脂培养基，37 ℃培养 36 h，大肠杆菌 E. colik88 测定采用 EMB 培养平板，37 ℃培养 24 h。 1.3 数据处理 微生物及 pH 值数据采用 SAS6.12 的 t-test 过程 进行两组均数的差异显著性检验。 2 结果与分析 2.1 发酵过程中 pH 值的动态变化 2.1.1 不同发酵工艺对 pH 值的影响〔见表 3〕 在发酵过程中，液态转固态发酵起始〔0 h〕pH 值 明显优于固态发酵，差异显著〔P＜0.05〕。在随后的发 酵时间里，2 个发酵温度下，液态转固态发酵和固态 发酵 pH 值差异都不显著(P＞0.05)。这主要是因为液 态转固态发酵工艺中接种的益生菌株植物乳杆菌 发酵过程中产生的乳酸、乙酸等有机酸成分，在液 态转固态发酵时直接降低了饲料的 pH 值。因而 随着发酵时间的延长，pH 值趋向一致，所以差异不 显著。 2.1.2 不同发酵温度对 pH 值的影响〔见图 1〕 7 6 5 4 3 2 1 0 p H 值 0 2448 72 120238 液态转固态发酵 T1 液态转固态发酵 T2 固态发酵 T1 固态发酵 T2 时间〔h〕 图 1 不同发酵温度对 pH 值的影响 168 4.05±0.05 a 3.96±0.04 a 3.94±0.03 a 4.01±0.02 a 表 3 不同发酵处理对 pH 值的影响 0 5.82±0.02 a 6.40±0.03 b 5.82±0.02 a 6.40±0.03 b 24 4.54±0.10 a 4.49±0.01 a 4.22±0.04 a 4.19±0.01 a 48 4.28±0.06 a 4.29±0.05 a 3.97±0.03 a 3.96±0.05 a 72 4.15±0.02 a 4.15±0.02 a 3.86±0.01 a 3.87±0.02 a 120 3.95±0.01 a 3.94±0.06 a 3.90±0.04 a 3.86±0.04 a T1 液态转固态发酵 固态发酵 T2 液态转固态发酵 固态发酵 项目 培养时间〔h〕 注：同一温度下同列标注字母不同者差异显著〔P＜0.05〕。 下表同。 杨雪海等：饲料发酵工艺对益生菌增殖及大肠杆菌数量变化的影响 试 验 研 究 31从图 1 可见，液态转固态发酵和固态发酵在 T1、 T2 两个发酵温度下随发酵时间的延续均表现出逐渐 下降的趋势，在 120 h 时降到最低，随后出现轻微的 上升。在 24、48、72 h 三个时间点两种发酵工艺的pH 值 T2 明显低于 T1〔P＜0.05〕，在随后的时间未表现出明 显的差异(P＞0.05)。 2.2 发酵过程中植物乳杆菌菌数变化 2.2.1 不同发酵工艺对植物乳杆菌菌数的影响〔见表 4〕 从表 4 可知，发酵温度为 20 ℃〔T1〕时，48 h 以前 2 种发酵工艺的植物乳杆菌菌数差异显著 〔P＜0.05〕， 72 h 以后的各点差异不显著；而发酵温度为 30 ℃ 〔T2〕时，24 h 以前 2 种发酵工艺的植物乳杆菌菌数差 异显著〔P＜0.05〕，24 h 以后的各点差异不显著。 2.2.2 不同发酵温度对植物乳杆菌菌数的影响〔见图 2〕 12 10 8 6 4 2 0 菌 数 ( l o g c f u / g ) 0 2448 72 120238 液态转固态发酵 T1 液态转固态发酵 T2 固态发酵 T1 固态发酵 T2 时间〔h〕 图 2 不同发酵温度对植物乳杆菌菌数的影响 从图 2 可知，在 72 h 以内，液态转固态发酵和固 态发酵植物乳杆菌数菌数在 T1、T2 发酵温度下未表 现明显差异(P＞0.05)。但在随后的发酵时间里，表现出 显著的差异〔P＜0.05〕。T1 发酵温度下的植物乳杆菌菌 数优于 T2 发酵温度。 2.3 发酵过程中 E.colik88 的菌数变化 2.3.1 不同发酵工艺对 E.colik88 菌数的影响〔见表 5〕 由表 5 可见，在 T1 发酵温度下，液态转固态发酵 工艺和固态发酵工艺大肠杆菌 E.colik88 菌数表现出 较大的差异。液态转固态发酵大肠杆菌 E.colik88 呈 直线下降趋势，在 72 h 降到检测限以下，固态发酵那么 表现为先上升后下降趋势，固态发酵在 120 h 才降为 检测限以下。在 T2 发酵温度下，2 种发酵工艺大肠杆 菌 E.colik88 菌数在发酵 24 h 时差异显著〔P＜0.05)，随 后均降为检测限以下。 2.3.2 不同发酵温度对 E.colik88 菌数的影响〔见图3〕 从图 3 可见，液态转固态发酵大肠杆菌 E.coli k88 的菌数在 T1、T2 发酵温度下，呈直线下降趋势， 在 T1 温度下 72 h 降到检测限以下，而在 T2 温度下 48 h 就降到了检测限以下。固态发酵 E.colik88 菌数 那么表现为先上升后下降，在 T1 温度下，48 h 到达最高 值，随后出现下降，120 h 降到检测限以下，在 T2 温度 168 9.59±0.17 a 9.54±0.20 a 8.91±0.12 a 8.93±0.09 a 表 4 不同发酵处理对植物乳杆菌菌数的影响〔logcfu/g〕 0 8.20±0.20 a 6.15±0.15 b 8.20±0.20 a 6.15±0.15 b 24 9.53±0.10 a 9.41±0.11 b 9.63±0.23 a 9.49±0.14 b 48 9.62±0.08 a 9.47±0.09 b 9.59±0.09 a 9.57±0.21 a 72 9.63±0.23 a 9.54±0.14 a 9.60±0.18 a 9.53±0.05 a 120 9.56±0.14 a 9.56±0.17 a 8.86±0.08 a 8.93±0.