2023年枝状枝孢霉MD紫杉醇合成相关候选基因A1182和A1251的超表达分析.doc

紫杉醇作为一种高效、广谱的抗癌药物，它在内生真菌中的含量直接决定了该菌株的药用价值。HPLC法通常作为检测紫杉醇的根本方法，常用于定量分析紫杉醇含量。可根据保存时间判断是否含有紫杉醇和紫杉烷类代谢产物[4]。10-去乙酰紫杉醇〔10-deacetylpaclitaxel，10-DAP〕是理想的紫杉醇半合成前体，而7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇〔7-Xylosyl-10-deacetylpaclitaxel，10-DAXP〕可以转化为10-去乙酰紫杉醇。多烯紫杉醇〔Docetaxel〕是紫杉醇的衍生物，通过干扰细胞有丝分裂和分裂间期细胞功能所必须的微管网络而具有抗肿瘤作用。本章研究我们利用高效液相色谱技术〔HPLC〕对过表达枝霉MD2菌株A10182-MD2、A10251-MD2所含有的紫杉醇、及紫杉醇前体巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰巴卡亭Ⅲ、7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇、10-去乙酰紫杉醇、多烯紫杉醇的含量进行检测，考察这些成分在过表达MD2菌株中的含量情况及对照野生型MD2菌株的变化，为后期的实验提供根底。 PDL、PDA培养基的配方同第三章。 表仪器概览 仪器名称 生产厂家 安捷伦1200Series高效液相色谱仪 KQ-500E型超声波清洗仪 Southern电泳仪 美国BIO-RAD公司 METTLERTOLEDO分析天平 瑞士 SHZ-Ⅲ循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂 RE-52型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂 枯燥箱 分子杂交仪 水浴锅 成像系统 QuantStudio5荧光定量PCR Nanodrop2023 上海精宏 上海乔枫 上海一恒 美国Synoptics公司 赛默飞世尔科技 赛默飞世尔科技 〔1〕购置 所有标准品均购自自赛默飞世尔科技尼龙膜购自BIOSHARP、DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKit〔forcolordetectionwithNBT/BCIP〕购自Roche。 〔2〕试剂的配置 ①：称取的NaCl，用超纯水定容至200mL。 ②：称取4g的NaOH，用超纯水定容至200mL。 ③：用量筒量取的浓盐酸，用100mL超纯水稀释，待溶液冷却后，用超纯水定容至1L。 ④20×SSC：称取，柠檬酸钠.2H2O，800mL的水溶解，用浓HCL调PH至，定容至1L，高温高压灭菌20min备用。 ⑤马来酸缓冲液：称取马来酸，，先用900mL的超纯水溶解，在20℃用NaOH调pH至后，定容至1L，高温高压灭菌20min备用。 ⑥洗膜缓冲液：称取马来酸，，先用900mL的超纯水溶解，再参加3mLTween20，在20℃用NaOH调pH至后，定容至1L，高温高压灭菌20min备用。 ⑦检测缓冲液：称取，用900mL的超纯水溶解后，参加100mL1MTris-HCl〔称取碱，加超纯水充分搅拌溶解，调至pH至，定容至100mL〕，在20℃调pH至后，定容至1L，高温高压灭菌20min备用。 ⑧TE缓冲液：称取，用900mL的超纯水溶解后，参加10mL1MTris-HCl，调pH至后，定容至1L，高温高压灭菌20min备用。 ⑨10%SDS：称取10gSDS，参加80mL超纯水溶解〔68℃促溶〕，调至，定容至100mL，高温高压灭菌20min备用。 分析转基因菌株中目的基因的整合情况 〔一〕探针的标记 1.以MD2基因组DNA为模板，扩增UnigeneA10182、A10251，经琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，测量回收产物浓度。 2.取1μg回收产物,用ddH2O补足至16μL。100℃沸水浴10min使DNA变性后迅速插入冰水混合物中。 3.根据DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKit〔forcolordetectionwithNBT/BCIP〕的操作方法进行后续实验。 4.加4μLDIG高效引物到已变性的DNA中，短暂离心后参加2μL预染Marker,37℃标记4h.。 ℃作用10min终止标记反响。-20℃保存备用。 〔二〕基因组DNA的提取 提取MD2、MD2转化子的基因组DNA，方法同2.4.1“改进SDS-CTAB〞法。提取完成后参加RNaseA37℃作用1h后参加苯酚/氯仿〔1:1，V/V〕抽提一次，以去除RNA的干扰。 〔三〕基因组DNA的限制酶切 用构建表达载体时所设计的目的基因两端的酶和表达框两端的酶对枝霉MD2〔阴性对照〕、过表达载体质粒〔阳性对照〕、MD2转化子基因组DNA进行酶切。酶切体系如下： 表酶切体系 TableThesystemofrestrictionenzymereaction 组分 体积 基因组DNA/表达框质粒 FDbuffer 酶Ⅰ 酶Ⅱ ddH2O 20μg 3μL 5μL 5μL to30μL 12023rpm离心，保证反响体系的精确，37℃酶切16h;65℃水浴10min，终止酶切反响。 〔四〕DNA片段电泳别离 采用0.8%的琼脂糖凝胶，先用200V电压电泳10min，再调节电压至30V电泳16h。电泳结束后，小心取出胶，切左上方小角做标记。 〔五〕转膜 1.脱嘌呤处理：当目的片段大于15Kb时，需要进行脱嘌呤处理。将胶置于盐酸中处理10-15min。当溴酚蓝由蓝色变为橘黄色时，证明胶已处理完成。用双蒸水漂洗两次，每次20min。 2.碱变性：将胶浸泡于、变性液中30min。 3.中和：用双蒸水漂洗凝胶后置于1mol/LTris-HCl、中和液中浸泡两次，每次15min。 4.搭建转移平台：在一个大池盘中放置一块比凝胶大的平台，倒入转移液，但转移液液面要低于平台，在平台上铺三张已在转移液中浸泡过的滤纸，用干净的玻璃棒轻轻推走滤纸间的气泡，滤纸两端垂入转移液中，按凝胶大小剪裁一张尼龙膜，剪去左上方小角以做标记，并置于转移液中浸泡5min。 5.将胶从中和液中小心取出，使其反面向上，置于转移平台中的滤纸上，小心赶走滤纸与胶间的气泡；用封口膜围绕胶的四周外缘的无DNA区，防止转膜出现短路的情况。 6.将尼龙膜置于胶上，使其缺角与胶的缺角对应。剪取三张与胶大小一样的滤纸置于膜上，小心赶走它们之间的气泡。 7.在滤纸上防置一叠吸水纸，然后在吸水纸上压约500g重物。转移16-18h，每隔3h换置一次吸水纸。在池盘中倒入足够的转移液以保证转移的顺利进行。 8.转移结束后，弃去吸水纸、滤纸，翻转膜，在膜上小心标记以区分点样位置和正反面。 9.将凝胶用溴化乙锭染色，于紫外灯下观察，确定是否转移完全，转移完全再进行以下步骤。 10.将膜置于保鲜膜上，晾干，于紫外灯下交联〔254nm，1200J/cm2，30-45s〕，使DNA固定在膜上。 〔六〕预杂交 将膜放入杂交瓶中，参加预杂交液〔每平方厘米尼龙膜约L预杂交液〕，置于已45℃预热的杂交箱中预杂交2h。 〔七〕杂交 弃去预杂交液，按相同的体积参加杂交液，并于杂交液中参加探针〔探针使用浓度为25ng/mL杂交液〕，置于45℃杂交箱中杂交16h。 〔八〕洗膜 取出杂交膜，使用以下溶液，依次进行洗膜： 1.2×SSC，0.1%SDS，浸膜。 2.2×SSC，0.1%SDS，室温洗膜两次，每次15min。 3.×SSC，0.1%SDS，68℃洗膜两次，每次15min。 4.×SSC，0.1%SDS，室温洗膜两次，每次15min。 洗膜完毕后用滤纸将膜上的水分吸干。 〔九〕显色 1.将膜置于Washingbuffer中，室温温育5min。 2.在封闭液中室温缓慢震荡15min。 3.弃去封闭液，用10ml含有1：10000的抗地高辛的碱性磷酸酶结合物的封闭液室温震荡15min。 4.将膜置于Washingbuffer中，室温漂洗两次，每次15min。 5.将膜置于Detectionbuffer中，室温漂洗膜2min。 6.将膜取出，用吸水纸吸去多余水分，置于暗室中，DNA面朝上，吸取5ml底物显色液〔含有100μLNBT/BCIPstocksolution的检测缓冲液〕小心滴加在膜外表，使膜完全被覆盖，暗室显色30min，观察结果。 qRT-PCR分析过表达菌株中目的基因的表达量 1.候选基因qRT-PCR引物的设计 根据qRT-PCR引物设计要求设计候选基因A10182和A10251的引物，选取18SrDNA作为内参，引物设计如下： 表2.2克隆候选基因的引物序列 Table2.2Sequencesoftheprimersforcloningcandidategenes 引物名称 引物序列 A10182QF 5'-CGCAGACCTTGTTCGACCGATC-3' A10182QR 5'-CGTTGGATACCAAGCACGTACTCG-3' A10251QF 5'-CGATCAAGCAGCAGCAGTAGAGG-3' A10251QR 5'-CCGATGGTCTGTGTTGATGGTGAG-3' 2.转基因菌株的培养 分别挑选三个A10182转基因菌株的转化子与A10251转基因菌株的转化子及对照枝状枝孢霉MD2接种于100mL含有30μg/mLHygB和100μg/mLCef抗性的PDL培养基中，28℃，150rpm培养5d后分别添加200μmMeJA后继续培养0h、6h、12h、18h、24h、30h，收集菌体。 2.转基因菌株总RNA的提取 〔1〕取约0.1g菌体于预冷研钵中，迅速参加液氮研磨至粉末，转移至2mL预冷的EP管中； 〔2〕参加750μLTRIZOL提取液剧烈震荡摇匀，室温静置5min； 〔3〕参加300μL氯仿，剧烈颠倒EP管15s，室温静置3min，12023×g，4℃离心15min； 〔4〕溶液呈现分层现象，吸取上层溶液至一新的EP管中，参加等体积氯仿，剧烈颠倒EP管5min，12023×g，4℃离心15min； 〔5〕取上清于一新的EP管中，参加等体积的异丙醇，静置10min，12023×g，4℃离心15min，沉淀RNA； 〔6〕75%乙醇洗涤沉淀，7500×g，4℃离心5min，弃乙醇，瞬时离心以去除管壁上的残留乙醇； 〔7〕在酒精灯旁晾干沉淀，参加50μL无核酶水溶解沉淀； 〔8〕取3μLRNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳检测200V，5min，并利用Nanodrop2023检测RNA的质量，并其余样品保存于-80℃。 3.第一链cDNA的合成 采用ThermoRevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit进行RNA的反转录，步骤如下： 〔1〕RNA的变性 RNA的变性反响体系如下： 表变性反响体系 degeneration 成分 用量(μL) RNasefreeddH2O 7 oligo(dT) 1 总RNA 4 总反响体积 12 65℃水浴变性10min，立即置于冰上。 〔2〕RNA的反转录 反转录RNA的反响体系如下： 表RNA反转录反响体系 reversetranscription 成分 用量(μL) RNase变性液 12 5×ReactionBuffer 4 dNTPMixture(10mmol/L) 2 RevertAidM-MuLVRT(200U/μL) 1 RibolockRNaseinhibitor(20U/μL) 1 总反响体积 20 轻柔混匀并瞬时离心，42℃孵育60min后75℃孵育5min，得到的反转录产物保存于-70℃备用。 4.qRT-PCR分析 采用实时荧光定量试剂盒SYBRGreenRealtimePCRMasterMix,应用QuantStudio5Real-TimePCRSystem进行表达量的分析： 将