土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课)...ppt

课题课题2 2 土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分离与计数 专题专题2 2 微生物的培养与应用微生物的培养与应用 一、课题背景一、课题背景 1 1、尿素尿素的利用的利用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。才能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶脲酶 CO(NHCO(NH2 2)2 2 脲酶脲酶 +H+H2 2O O +CO+CO2 2 NHNH3 3 3 3、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌。某些真菌和放线菌。4 4、课题目的、课题目的 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 一一.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照 1 1、实例：、实例：启示启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。原因原因：因为热泉温度：因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大，淘汰了绝大多多 数微生物只有数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶链式反应是多聚酶链式反应是一种在体外将少量一种在体外将少量DNADNA大量复制的技术，此项大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温技术要求使用耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶聚合酶。要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；括营养、生理、生长条件等；方法：方法：抑制大多数微生物不能生长抑制大多数微生物不能生长 造成有利于该菌生长的环境造成有利于该菌生长的环境 结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。释等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温包括营养、温度、度、pH等等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。，同时抑制或阻止其他微生物生长。15.0g15.0g 琼脂琼脂 1.0g1.0g 尿素尿素 10.0g10.0g 葡萄糖葡萄糖 0.2g0.2g MgSOMgSO447H7H2 2O O 2.1g2.1g NaHNaH2 2POPO4 4 1.4g1.4g KHKH2 2POPO4 4 3 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培培养基：养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基 在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素氮源：尿素 思考思考2该培养基对微生物该培养基对微生物 （具有，（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是机制是 。具有具有 只有能够以尿素作只有能够以尿素作为氮源的微生物才为氮源的微生物才能在该培养基上生能在该培养基上生长长 培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以物才能分解尿素，以尿素尿素作为氮源。缺乏脲酶的作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。选择出分解尿素的微生物。4 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理 1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。里样品中微生物的数量。（二）（二）.统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点 （比例计数法）（比例计数法）待测样品待测样品 等量的已知含量的红细胞等量的已知含量的红细胞 混匀混匀 涂抹涂抹 测定：测定：红细胞数目红细胞数目 细菌数目细菌数目 计算单位体积内的细菌数目计算单位体积内的细菌数目 将含已知数目的红细胞液体与待测的菌液按将含已知数目的红细胞液体与待测的菌液按1：1均匀混合，在显微镜下数出各自的数目，然后求菌液均匀混合，在显微镜下数出各自的数目，然后求菌液中的细胞数目。中的细胞数目。细菌细菌 红细胞红细胞【补充补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。显微镜直接计数是测定微生物的方法。举例：已知红细胞浓度为举例：已知红细胞浓度为M个个/mL，从，从体积为体积为N mL的大肠杆菌培养液中取出大杆的大肠杆菌培养液中取出大杆菌液与红细胞液等量均匀混合后，涂片，染菌液与红细胞液等量均匀混合后，涂片，染色，镜检。在同一视野中发出有红细胞色，镜检。在同一视野中发出有红细胞W个，个，大肠杆菌大肠杆菌Y个，求个，求NmL大肠杆培养液中大肠大肠杆培养液中大肠杆菌的个数杆菌的个数X是多少？是多少？XN M Y W(个个)观察到的红细胞平均数观察到的红细胞平均数/观察到的细菌平均数观察到的细菌平均数 红细胞含量红细胞含量/细菌含量细菌含量 公公 式式 2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固体在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：常用方法：稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M 其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。注意事项注意事项 为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板的平板上进行计数。上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三同一稀释度加到三个或三个以上的平皿个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出中，经涂布，培养计算出菌落平均数。菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目统计的菌落往往比活菌的实际数目低低。恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键，一般以三个稀释度中的一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的第二个稀释度所出现的平均菌落数在平均菌落数在5050个左右为最好个左右为最好。如何从平板上的菌落数推测出每克如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算值，然后按课本旁栏的公式进行计算 教材教材P22 计数法计数法 直接计数法、直接计数法、平板计数法、平板计数法、比浊法、比浊法、膜过滤法膜过滤法 实例分析实例分析P22 你认为哪个同学的结果更接近真实你认为哪个同学的结果更接近真实值？值？你认为这两位同学的实验需要改进你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？吗？如果需要，如何改进？实例分析实例分析P22 第一同学只涂布了一个平板，第一同学只涂布了一个平板，没有设置没有设置重复组，因此结果不具有说服力。重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是涂布了三个平板，但是其中其中1个平板的计个平板的计数结果与数结果与2个相差太远，说明在操作过程个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地中可能出现了错误，因此，不能简单地将将3个平板的计数值用来求平均值个平板的计数值用来求平均值。设置对照的设置对照的主要目的主要目的是是排除实验组中非测试排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。（三）（三）.设置对照：设置对照：实例：教材实例：教材P23P23 原因：原因：土样不同土样不同，培养基污染或操作失培养基污染或操作失误误(或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，说服力，对照的设置是必不可少的对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：将方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：如果结果与结果预测：如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。菌落计数菌落计数 配制土壤配制土壤溶液溶液 系列稀释系列稀释 涂布平板涂布平板与培养与培养 根据图示根据图示27填写以下实验流程：填写以下实验流程：试验设计：试验设计：实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。用前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。准备准备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和选择培养基选择培养基将菌将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照对照，用来，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为个较为宽泛的范围：稀释倍数为10103 310107 7。每个。每个稀释度下需要稀释度下需要3 3个个选择培养基，选择培养基，1 1个牛肉膏蛋白胨个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要培养基，因此共需要1515个选择培养基，个选择培养基，5 5个牛肉个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8 8个个灭菌的试灭菌的试管和管和1 1个个灭菌的移液管。灭菌的移液管。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行 分离