土壤中分解尿素的细菌的分离和计数-上课用.ppt

一、课题背景一、课题背景 1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之之后才能被植物利用。后才能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶脲酶 CO(NHCO(NH2 2)2 2 脲酶脲酶 +CO+CO2 2 NHNH3 3 +H2O 3 3、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。也能分解尿素。4 4、课题目的、课题目的 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 一一.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照 1 1、实例：、实例：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。问：问：如果请你寻找这种耐高温的酶，你会去如果请你寻找这种耐高温的酶，你会去哪里寻找？哪里寻找？DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应（PCRPCR）是一种在体外是一种在体外将将少量少量DNADNA大量复制大量复制的技术，此项技术要求使的技术，此项技术要求使用用耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶（93930 0C C）。.筛选菌株筛选菌株 问：问：为什么为什么TaqTaq细菌能从热泉中被筛选出来？细菌能从热泉中被筛选出来？水生耐热细菌水生耐热细菌TaqTaq：美国科学家布鲁克于美国科学家布鲁克于19661966年在美国黄石国家公园的一个热泉中发现，并分年在美国黄石国家公园的一个热泉中发现，并分离出耐高温的离出耐高温的TaqDNATaqDNA聚合酶。聚合酶。原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，高温高温淘汰淘汰了绝大多数微生物（了绝大多数微生物（不耐热不耐热），只有），只有TaqTaq细菌细菌被筛选出来。被筛选出来。【研究思路研究思路】（一）筛选菌株（一）筛选菌株 原理：原理：人为提供有人为提供有利于目的菌株利于目的菌株生长的生长的条件（包括营养、温度、条件（包括营养、温度、PHPH等），等），同时同时抑制或阻止抑制或阻止其他微生物生长。其他微生物生长。有选择作用 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基 方法：方法：抑制大多数微生物生长抑制大多数微生物生长 造成有利于该菌生长的环境，造成有利于该菌生长的环境，结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。涂布平板法等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：15.0g15.0g 琼脂琼脂 1.0g1.0g 尿素尿素 10.0g10.0g 葡萄糖葡萄糖 0.2g0.2g MgSOMgSO447H7H2 2O O 2.1g2.1g NaHNaH2 2POPO4 4 1.4g1.4g KHKH2 2POPO4 4 3 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属属于哪类培养基？于哪类培养基？固体培养基固体培养基 在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素 选择培养基选择培养基 培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能只有能合成脲酶合成脲酶的微生的微生物才能利用尿素作为氮源而生存物才能利用尿素作为氮源而生存。缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。4 4、该培养基如何将分解尿素的细菌选择出来？、该培养基如何将分解尿素的细菌选择出来？选择培养基：选择培养基：在微生物学中，将允许特定在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。微生物生长的培养基。组别组别 培养基类型培养基类型 是否涂是否涂布接种布接种 目目 的的 实验组实验组 以尿素为唯一氮源以尿素为唯一氮源的选择性培养基的选择性培养基 是是 对照组对照组 牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨 培养基培养基 是是 分离尿素细菌分离尿素细菌 用以判断选择性培养用以判断选择性培养基是否具有选择性基是否具有选择性 对设计实验的训练对设计实验的训练 对照组对照组 牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基 实验组实验组 以尿素为氮源的培养基以尿素为氮源的培养基 【统计菌落数目统计菌落数目】常用方法：常用方法：稀释涂布平板法稀释涂布平板法、显微镜、显微镜直接计数法，直接计数法，还可以用过滤膜法还可以用过滤膜法 1 1、稀释涂布平板法、稀释涂布平板法（也叫活菌计数法）（也叫活菌计数法）（1 1）原理）原理：当样品的稀释度足够高时，：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。活菌。1 1个菌落个菌落 =1=1个活菌个活菌 稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。（2 2）操作方法：稀释涂布平板）操作方法：稀释涂布平板 统计菌落统计菌落数。数。（3 3）统计原则）统计原则 、选、选 3030300 300 个菌落的平板统计。个菌落的平板统计。、每个稀释度取、每个稀释度取3 3个平板取其平均值。个平板取其平均值。（4 4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此统计结果一般用目低，因此统计结果一般用菌落数菌落数来表示。来表示。同学同学 平板平板1 1 平板平板2 2 平板平板3 3 平均数平均数 评价评价 甲甲 230230 230230 乙乙 2121 212212 256256 163163 结论结论 启示启示 没有设置重复组，因此结果没有设置重复组，因此结果不具说服力。不具说服力。1 1个平板的计数结果与另个平板的计数结果与另2 2个个 相差太远，说明在操作过程相差太远，说明在操作过程 中可能出现了错误。中可能出现了错误。不能简单地将不能简单地将3 3个平板的计数值用来求平均值。个平板的计数值用来求平均值。在设计实验时，一定要涂布至少在设计实验时，一定要涂布至少3 3个平板，作为重复组，才能个平板，作为重复组，才能 增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑 所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。需要重新实验。统计菌落数目统计菌落数目 P22 注意事项注意事项 为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出，经涂布，培养计算出菌落平均数。菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在落数在5050个左右为最好。个左右为最好。（三）设置对照 在做本课题的实验时，在做本课题的实验时，A A 同学从对应同学从对应10106 6倍稀释的培养基中筛倍稀释的培养基中筛选出大约选出大约150150个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择出个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择出大约大约5050个菌落。个菌落。其他同学认为其他同学认为A A同学的结果有问题。他们分析可能是同学的结果有问题。他们分析可能是A A同学的培同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。但是，但是，A A同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，A A同同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿了不出令人信学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿了不出令人信服的证据。服的证据。你能通过设置对照，帮助你能通过设置对照，帮助A A同学学排除上述两个可能影响实验同学学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？结果的因素吗？设置对照的主要目的设置对照的主要目的是排除实验组中非测试是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。.设置对照：设置对照：设置对照的方法：设置对照的方法：空白对照：不给对照组任何处理因素。空白对照：不给对照组任何处理因素。条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的 处理因素。处理因素。自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。A A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。种。一是由于土样不同一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误二是由于培养基污染或操作失误。小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。二二.实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤