土壤中分解尿素的细菌的分离和计数.ppt

课题背景课题背景 1 1、关于尿素、关于尿素 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。但是它但是它不能直不能直接接被农作物被农作物吸收。吸收。只有当土壤中的细菌将尿素只有当土壤中的细菌将尿素分分解成氨解成氨之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。2 2、细菌分解尿素的原因、细菌分解尿素的原因脲酶脲酶 土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶 CO(NHCO(NH2 2)2 2 脲酶脲酶 +CO+CO2 2 NHNH3 3 +H2O 课题目的：课题目的：一、从土壤中分离出能够分解尿素的细菌一、从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 二、统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细二、统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌菌 一、如何从土壤中分离出能够分解尿素的一、如何从土壤中分离出能够分解尿素的细菌？细菌？土壤有“微生物的天然培养基”之称。同土壤有“微生物的天然培养基”之称。同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。尤其是在富含有机质的土壤中，大，种类最多。尤其是在富含有机质的土壤中，有更多的微生物。而这些微生物中只有一小部有更多的微生物。而这些微生物中只有一小部分能够分解尿素。那么如何能从众多的微生物分能够分解尿素。那么如何能从众多的微生物中筛选出能够分解尿素的细菌呢？中筛选出能够分解尿素的细菌呢？资料一：资料一：思考：思考：1 1、科学家为什么能从热泉中筛选出耐高温的、科学家为什么能从热泉中筛选出耐高温的TaqTaq细菌？细菌？DNADNA多聚酶链式反应（多聚酶链式反应（PCRPCR）是）是一种在体外将少量一种在体外将少量DNADNA大量复制的技大量复制的技术，而此项技术的实施必须使用耐术，而此项技术的实施必须使用耐高温（高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。美国微生物学家托马斯美国微生物学家托马斯 布鲁克于布鲁克于1966年在美国黄石年在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了水生耐热细菌国家公园的一个热泉中发现了水生耐热细菌Taq，并从，并从它体内分离出了耐高温的它体内分离出了耐高温的TaqDNA聚合酶。聚合酶。因为热泉温度为因为热泉温度为707080800 0C C，淘汰了绝大多数微生物只，淘汰了绝大多数微生物只有有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。2、从上述资料中你能得到什么启示？、从上述资料中你能得到什么启示？实验室中微生物的筛选，也是应用同样的原实验室中微生物的筛选，也是应用同样的原理：即理：即人为提供有利于目的菌株生长的条件人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括包括营养、温度、营养、温度、pHpH等等)，同时抑制或阻止其他微生物，同时抑制或阻止其他微生物生长。生长。也就是利用也就是利用选择培养基选择培养基筛选出你想要的目筛选出你想要的目的菌株。的菌株。比如：比如：不加氮源的培养基不加氮源的培养基固氮菌固氮菌 不加碳源的培养基不加碳源的培养基自养微生物自养微生物 加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 允许特定种类的微生物生允许特定种类的微生物生 长，同时抑制或阻止其他种长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。类微生物生长的培养基。以以尿素为唯一氮源尿素为唯一氮源的培养基的培养基能够分离尿素的能够分离尿素的细菌细菌 只有能分解尿素的细菌才能分解尿素，以尿素作为氮只有能分解尿素的细菌才能分解尿素，以尿素作为氮源。而不能分解尿素的微生物由于不能分解尿素，缺乏源。而不能分解尿素的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而无法生长繁殖，所以用此培养基就能够选择出能氮源而无法生长繁殖，所以用此培养基就能够选择出能够分解尿素的细菌。够分解尿素的细菌。思考：思考：什么样的培养基能选择培养出能够分离尿素的细什么样的培养基能选择培养出能够分离尿素的细 菌呢？菌呢？思考：思考：1、该培养基中有哪些成分？它们分别为微生物生长提供该培养基中有哪些成分？它们分别为微生物生长提供了什么营养？了什么营养？2 2、从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上看、从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上看属于哪属于哪类？类？1 1、显微镜直接计数法显微镜直接计数法全部全部细菌数细菌数 利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。里样品中微生物的数量。统计菌落数目的方法：统计菌落数目的方法：二、如何统计每克土壤样品中究竟含有多少二、如何统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌？这样的细菌？2 2、稀释涂布平板法稀释涂布平板法活活菌数菌数（最常用）（最常用）3 3、滤膜法滤膜法 计算方法：计算方法：每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M 其中，其中，C C某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V V涂布平板时所用的稀释液的体积涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)(ml)，M M稀释倍数。稀释倍数。当样品的当样品的稀释度稀释度足够高时，培养基表面生长的足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。大约含有多少活菌。原理：原理：稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：注意事项：注意事项：为了保证结果准确，为了保证结果准确，一般选择菌落数在一般选择菌落数在3030300300的平板进行计数的平板进行计数。设置重复组设置重复组：为使结果接近真实值可将同一：为使结果接近真实值可将同一稀释度加到稀释度加到三个或三个以上三个或三个以上的培养皿中，经涂的培养皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。布，培养计算出菌落平均数。设置对照组设置对照组：将不加土样的培养基置于相同：将不加土样的培养基置于相同条件下进行培养，作为条件下进行培养，作为空白对照空白对照。统计的菌落往往比活菌的实际数目低统计的菌落往往比活菌的实际数目低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。菌落。讨论题讨论题1 1：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为对应稀释倍数为10106 6的培养基中，得到以下两种统计结果。的培养基中，得到以下两种统计结果。1 1、第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为、第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230230。2 2、第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分、第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为别为2121、212212、256256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163163作作为统计结果。为统计结果。分析：你认为哪位同学的结果更接近真实值？你认为这两位同分析：你认为哪位同学的结果更接近真实值？你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？甲只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说甲只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。服力。乙有一个平板与另外两个平板相差很大，说明操作过程可能乙有一个平板与另外两个平板相差很大，说明操作过程可能有误，必须重做实验。有误，必须重做实验。1、实验时必须设置重复组，、实验时必须设置重复组，至少要涂布至少要涂布3个平板。个平板。2、分析结果时，一定要考虑、分析结果时，一定要考虑所设置的重复组结果是否一致，所设置的重复组结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，结果不一致，意味着操作有误，需要重做实验。需要重做实验。讨论题讨论题2 2：在做本课题的实验时，在做本课题的实验时，A A 同学从对应同学从对应10106 6倍稀释的培养基中筛选倍稀释的培养基中筛选出大约出大约150150个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择出大约个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择出大约5050个菌落。个菌落。其他同学认为其他同学认为A A同学的结果有问题。他们分析同学的结果有问题。他们分析可能是可能是A A同学的培养同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。但是，但是，A A同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同自己所选用的土壤样品不同。但是，。但是，A A同学在同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿了不出令人信服的证设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿了不出令人信服的证据。据。分析：你能通过设置对照，帮助分析：你能通过设置对照，帮助A A同学学排除上述两个可能影响同学学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？实验结果的因素吗？通过这个事例可以看出，实验结果要通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，有说服力，对照的设置对照的设置是必不可少的。是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。如果结果与如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误；如果结无误；如果结果不同，则证明果不同，则证明A A同学存在操作失误或培养基的配同学存在操作失误或培养基的配制有问题。制有问题。对照实验是指除了被测试的对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照实验的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因组，排除任何其他可能原因的干扰的干扰 三三.实验的具体操作实验的具体操作 （一）（一）.土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。（二）（二）.制备培养基制备培养基 制备制备以尿素为唯一氮源的以尿素为唯一氮源的选择培养基和牛选择培养基和牛肉膏蛋白胨固体培养基。肉膏蛋白胨固体培养基。筛选出能够分解筛选出能够分解尿素的细菌尿素的细菌 与选择培养基作对照，与选择培养基作对照，检测选择培养基是否检测选择培养基是否具有选择作用具有选择作用 应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行 分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度 一般分离土壤中细菌，选用一般分离土壤中细菌，选用10104 4、10105 5、10106 6倍的稀释度倍的稀释度 分离土壤中放线菌，选用分离土壤中放线菌，选用10103 3、10104 4、10105 5倍的稀释度倍的稀释度 分离土壤中真菌，选用分离土壤中真菌，选用10102 2、10103 3、10104 4倍的稀释度倍的稀释度 第一次实验可将稀释度放宽一点，选择第一次实验可将稀释度放宽一点，选择10103 310107 7 （三三）样品的稀释样品的稀释 思考：思考：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度为什么分