土壤中分解尿素的细菌的分离与计数定稿ppt.ppt

课题课题2 2 土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分离与计数 一、课题背景一、课题背景 1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之之后才能被植物利用。后才能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶 CO(NHCO(NH2 2)脲酶脲酶 +CO+CO2 2 NHNH3 3 +H+H2 2O O 4 4、课题目的、课题目的 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样统计每克土壤样品中究竟含有多少这样 的细菌的细菌 一一.研究思路研究思路 .筛选菌株筛选菌株 .统计菌落数目统计菌落数目 .设置对照设置对照 1 1、实例：、实例：启示：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉温度原因：因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大多，淘汰了绝大多 数微生物只有数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应是是一种在体外将一种在体外将少量少量DNADNA大量复制大量复制的技术，此项的技术，此项技术要求使用技术要求使用耐高温耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。.筛选菌株筛选菌株 2 2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供人为提供有利于目的菌株生长有利于目的菌株生长的条件的条件(包括营养、温度、包括营养、温度、pHpH等等)，同时，同时抑制或阻止其抑制或阻止其他微生物他微生物生长。生长。什么是选择性培养基？什么是选择性培养基？15.0g15.0g 琼脂琼脂 1.0g1.0g 尿素尿素 10.0g10.0g 葡萄糖葡萄糖 0.2g0.2g MgSOMgSO447H7H2 2O O 2.1g2.1g NaHNaH2 2POPO4 4 1.4g1.4g KHKH2 2POPO4 4 3 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基 在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素 培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。5 5、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理 6 6、怎样证明此培养基具有选择性呢？、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为以尿素为 唯一氮源唯一氮源 的培养基的培养基 牛肉膏牛肉膏 蛋白胨蛋白胨 培养基培养基 是是 分离分离 尿素尿素 细菌细菌 判断该判断该 培养基培养基 有无选有无选 择性择性 实验组实验组 对照组对照组 培养基类型培养基类型 是否是否 接种接种 目的目的 结果结果 只生长尿只生长尿素细菌素细菌 生长多种生长多种微生物微生物 是是 6 6、怎样证明此培养基具有选择性呢？、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为以尿素为 唯一氮源唯一氮源 的培养基的培养基 牛肉膏牛肉膏 蛋白胨蛋白胨 培养基培养基 是是 分离分离 尿素尿素 细菌细菌 判断该判断该 培养基培养基 有无选有无选 择性择性 实验组实验组 对照组对照组 培养基类型培养基类型 是否是否 接种接种 目的目的 结果结果 只生长尿只生长尿素细菌素细菌 生长多种生长多种微生物微生物 是是 1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。.统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点 2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的体培养基上所形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单一个单细胞细胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个菌落代表原先的一个单细胞。一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M 其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。注意事项注意事项 为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加为使结果接近真实值可将同一稀释度加到到三个或三个以上三个或三个以上的平皿中，经涂布，培的平皿中，经涂布，培养计算出菌落养计算出菌落平均数平均数。统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的实际数目低实际数目低。设置对照的主要目的是排除实验组中设置对照的主要目的是排除实验组中非测非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。的可信度。.设置对照：设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌 落数目的实验时，落数目的实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6 倍稀释的培养基中筛选出大约倍稀释的培养基中筛选出大约150150个菌个菌 落，但是其他同学在同样的稀释度下落，但是其他同学在同样的稀释度下 只选择出大约只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：原因：土样不同土样不同，培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误 (或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质)小结：小结：通过这个事例可以看出，实验结果通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。二二.实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行火焰旁进行 三三 样品的稀释样品的稀释 .取样涂布取样涂布 实验时要对实验时要对培养皿作好标记培养皿作好标记。注明培。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。等。.取样涂布取样涂布 分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度 稀释倍数稀释倍数 目的目的 细菌细菌 10104 4、10105 5、10106 6 保证获得菌落保证获得菌落数在数在3030300300之间、适于计之间、适于计数的平板数的平板 放线菌放线菌 10103 3、10104 4、10105 5 真菌真菌 10102 2、10103 3、10104 4 原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同 .微生物的培养与观察微生物的培养与观察 在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d 放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d 霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上个以上菌落数目在菌落数目在3030300300的平板，则说明稀释操作比较成功，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确精确，需要重新实验。，需要重新实验。微生物的培养与观察微生物的培养与观察 三三.结果分析与评价结果分析与评价 1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030300300个个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。四、操作提示四、操作提示 无菌操作无菌操作 做好标记做好标记 规划时间规划时间 五五.课外延伸课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝 培养培养基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记述得出，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 ,有或无金属光泽有或无金属光泽 大肠杆菌在伊大肠杆菌在伊红美蓝琼脂红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 本课题知识小结本课题知识小结:六、例题解析六、例题解析 例例1 1对细菌群体生长规律测定正确的表述是对细菌群体生长规律测定正确的表述是 A A在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B B至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C C接种一个细菌接种一个细菌