7重组体克隆的筛选和鉴定.pptx

一、抗药性标记及其插入失活选择法一、抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因质粒上有两个抗菌素抗性基因:Tetr和和Ampr。Tetr上有插入位点上有插入位点BamH I和和Sal I;Ampr上有插入位点上有插入位点Pst I。第一节第一节 载体表型选择法载体表型选择法 1.原理：原理：pBR322（1）四环素）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：）氨苄青霉素抗性基因：2.pBR322抗菌素标记选择 产生产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：）环丝氨酸：3.选择过程：选择过程：如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，导致四环素抗，导致四环素抗性基因失活，可用性基因失活，可用四环素加环丝氨酸四环素加环丝氨酸平板培平板培养基选择重组克隆。养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活 无环丝氨酸培养基无环丝氨酸培养基（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，导致氨苄，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素青霉素指示液选择。指示液选择。二、二、-半乳糖苷酶显色反应选择法半乳糖苷酶显色反应选择法 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 乳糖乳糖 半乳糖半乳糖 葡萄糖葡萄糖 Xgal 半乳糖半乳糖 5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝+深蓝色深蓝色 1.原理：原理：载体载体上有一段上有一段-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（Lac Z）的）的 片段片段（氨基端），其上有外源（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。的插入位点。受体菌受体菌基因组基因组中有突变的中有突变的-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（片段缺片段缺失）。可以被失）。可以被IPTG诱导表达。诱导表达。载体和受体菌基因组载体和受体菌基因组可以可以互补互补形成完整有功能的形成完整有功能的-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。假阳性：假阳性：如果插入的外源如果插入的外源DNA正好是正好是3的倍数并且没有的倍数并且没有中止密码；（不破坏中止密码；（不破坏 肽）。肽）。2.选择过程选择过程 -半乳糖苷酶使半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。分解成兰色产物。利用插入的外源基因的利用插入的外源基因的表达产物表达产物特性进行直特性进行直接选择。（只在特定条件下）。接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。体菌株的突变型缺陷。一、原理：一、原理：第二节第二节 根据插入基因的表型选择根据插入基因的表型选择 1.弥补缺陷弥补缺陷 his-his+受体菌：受体菌：外源基因：外源基因：在不含组氨酸的在不含组氨酸的培养基中生长培养基中生长 小鼠的二轻叶酸还原酶（小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。苄二氨嘧啶有抗性。DHFR 载体载体 连接连接 转化受转化受体菌体菌 三甲氧苄二氨嘧三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板啶培养基平板 含含DHFR的克隆才能生长的克隆才能生长 例：例：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。2.增加新性状增加新性状 利用有插入片段的重组载体的分子量比利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。野生型载体分子量大。一、直接电泳检测法一、直接电泳检测法 从转化后的菌体克隆从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、中分离质粒，电泳、比较其分子量。比较其分子量。第三节第三节 DNA电泳检测法电泳检测法 分子量分子量 Marker 载体载体 重组克隆重组克隆 二、酶切电泳筛选法 1.原理：原理：根据已知的外源根据已知的外源DNA序列的限制性酶切序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。否符合预计的结果。A B A或或B 不同克隆的酶切结果 筛选过程筛选过程 表型筛选加酶切筛选表型筛选加酶切筛选AATTAATT三、PCR扩增检测法 1.原理原理 PCR能在模板序列上扩增出预期能在模板序列上扩增出预期DNA片断。片断。2.过程过程（1）从重组克隆中提取质粒（或）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。（2）用外源）用外源DNA插入片断引物作插入片断引物作PCR。（3）电泳）电泳PCR产物。产物。（4）检查是否有）检查是否有PCR产物。产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。产物的长度是否与外源基因一致。1.核酸核酸杂交杂交 第四节 核酸杂交检测法 一、原理：一、原理：重组克隆与探针杂交。重组克隆与探针杂交。3.识别标记识别标记 32P 或或 125I。（1）放射性同位素）放射性同位素 2.检测用的探针检测用的探针 与外源与外源DNA插入片断互补的序列。插入片断互补的序列。（2）非放射性标记）非放射性标记 荧光素荧光素 二、核酸杂交检测方法 用用DNA（或（或RNA）探针检测）探针检测DNA样品。样品。1.Southern blotting 从宿主细胞中提取从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），（或质粒载体），再用探针杂交。再用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。与探针杂交，在底片上曝光显示。酶切前酶切前 酶切后酶切后 插入片断插入片断 载体载体 Southern blot 筛选筛选结果结果 （1）原位杂交筛选）原位杂交筛选 特点：特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。可以直接找出阳性菌落。（2）R-环检测法 DNA-RNA杂交。杂交。1）原理：）原理：2）选择过程）选择过程 在在70%甲酰胺中，把甲酰胺中，把DNA双链变性，复双链变性，复性的时候，性的时候，DNA-RNA杂交分子比杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种双链更稳定。电镜下可见一种R-环环形结构。形结构。用外源基因的用外源基因的mRNA与重组载体杂交与重组载体杂交。缺点：需要电镜！缺点：需要电镜！2.Northern blotting 用用DNA（或（或RNA）探针检测探针检测RNA样样品。品。主要检测插入片主要检测插入片断是否被转录。断是否被转录。从宿主细胞中提从宿主细胞中提取取RNA，再用探，再用探针杂交。针杂交。利用抗体作为利用抗体作为“探针探针”来检测转入受体来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：的性质可分为几种作用方式：一、放射性抗体检测法一、放射性抗体检测法 第五节 免疫化学检测法 1.抗体与产物的结合方式抗体与产物的结合方式 对表达产物的检测。对表达产物的检测。蛋白蛋白蛋白蛋白“杂交杂交”待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白 一抗一抗 二抗二抗 125I 标记的二标记的二 抗结合蛋白抗结合蛋白 固相支固相支持滤膜持滤膜 待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白 一抗一抗 125I标记的二抗标记的二抗 固相支固相支持滤膜持滤膜 待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白 一抗一抗 固相支固相支持滤膜持滤膜 固相支固相支持滤膜持滤膜 待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白 一抗一抗 二抗二抗 125I 标记的二抗标记的二抗 结合蛋白结合蛋白 125I标记的二抗标记的二抗 2.放射性抗体检测法过程放射性抗体检测法过程 3.Broome-Gilbert双位点检测法双位点检测法 质粒基因质粒基因A 插入基因插入基因B 表达表达 质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B 融合蛋白融合蛋白 检测融合蛋白。检测融合蛋白。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。重组质粒重组质粒重组质粒重组质粒重组质粒重组质粒固相支固相支 持滤膜持滤膜 抗抗A抗体抗体 125I标记的标记的 抗抗B抗体抗体 质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B 质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B 固相支固相支 持滤膜持滤膜 抗抗A抗体抗体 发光，底片曝光发光，底片曝光 二、免疫沉淀检测法二、免疫沉淀检测法 把非放射性抗体加到平板培养基中，把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈沉淀圈”。1.原理原理 抗原抗原抗体凝集反应。抗体凝集反应。检测分泌型产物。检测分泌型产物。2.方法方法 对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。三、酶联免疫吸附测定（三、酶联免疫吸附测定（ELISA）Enzyme-linked immunosorbant assay 1.原理：原理：一抗（一抗（primary antibody）:与目标分子的特异结合。与目标分子的特异结合。二抗（二抗（secondary antibody）：）：与一抗的特异性结合。与一抗的特异性结合。酶连（酶连（enzyme-linke）：二抗上携带一种酶二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。（或光强度），从而推测目标分子的含量。待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白 一抗一抗 二抗二抗 酶酶 待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白 一抗一抗 二抗二抗 无色的底物无色的底物 有色的产物有色的产物 比色观察比色观察 酶酶 19 2.ELISA检测的一般步骤检测的一般步骤（1）固定样品）固定样品 将待测样品加入将待测样品加入96孔微量滴定板孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后）的孔中，干燥后就被固定在就被固定在孔底孔底。孔底孔底 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。（2）一抗结合）一抗结合 一抗一抗 加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。酶、脲酶等）。（3）二抗结合）二抗结合 二抗二抗 加入无色的底物，被二抗上所带的酶催加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。化反应转变成有色物质（或发光）。（4）显色反应）显色反应 在特殊的分光光度仪（在特殊的分光光度仪（酶标仪酶标仪）上比色，打）上比色，打印出结果。印出结果。（5）比色）比色 3.ELISA的局限性的局限性 有效，但准确性稍差（有效，但准确性稍差（主要取决于一抗主要取决于一抗的特异性的特异性）。）。必须与其他方法一起综合考虑。必须与其他方法一起综合考虑。最好用单克隆抗体（最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）临床检验常用的单抗临床检验常用的单抗 临床检验常用的单抗临床检