仁用杏品种鉴定技术规程　SSR分子标记法 LYT 2745-2016.pdf

LY/T2745-20164仪器设备与主要试剂、耗材仪器设备及试剂参见附录A。5溶液配置溶液配制方法参见附录B。6核心引物核心引物相关信息见附录C。7操作步骤7.1样品准备取待测品种和对照品种的新鲜、幼嫩、健康叶片各1片，分别做好标记，置于超低温冰箱保存。7.2DNA提取7.2.1待测品种和对照品种的DNA提取，采取以下步深：a)把叶子样品放入研钵中，加人液氮迅速察全细微颗粒状，取0.5g左右放人盛有1100LDNA提取液的2mL离心管中，加入2克基乙醇20L,颠倒离心管混匀：65恒温水浴1h,期间每隔10m震荡混匀一次，鴷余叶片样品用锡纸包裹放在液氮冰箱超低温保存；b)加入氯仿、异戊醇混合液(24：！)800L,静置10min15min后，常温12000r/min离心15min,取上清液于新的2mL离心管中，重复该步骤两次：c)向上清液加入一20预冷的无水乙醇1000L,轻轻颠倒离心管混匀，于一20冰箱静置1h以上；d)将离心管取出，于4、12000r/min转速下离心12min,弃上清液，70%乙醇洗涤沉淀物2次，无水乙醇洗涤2次，室温风干(10min左右)：e)加100L去离子水充分溶解DNA后，加10mg/mL的RNase酶1L,37温浴1h:f)将离心管取出，于4、12000r/min转速下离心12min,弃上清液，70%乙醇洗涤沉淀物2次，无水乙醇洗涤2次，室温风干(10mn左右)：g)室温风干的DNA,溶于1O0LTE缓冲液中；h)提取的DNA通过1.0%凉脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定质量和浓度后，用TE缓冲液稀释至50ng/L存放于一20冰箱备用。7.2.2若采用试剂盒法提取DNA,需按照试剂盒的说明进行提取，并按照8.2.1步骤h)的方法存放。7.3PCR扩增7.3.1PCR反应体系采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时，PCR反应体系为：总体积20L,其中9 uL Premix TaqVersion2.0,1L正向引物(10mol/L)、1L反向引物(10mol/L),1.5LDNA模板(20mg/L),7.5 uL ddH2(0。2