口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法细胞毒性试验：琼脂覆盖法及分子滤过法 YYT 0127.9-2001.pdf

YY/T0127.9-20014.1.2.23%琼脂或琼脂糖：用双蒸馏水配制3%琼脂或琼脂糖。高压蒸汽灭菌。4.1.2.3琼脂培养基的制备：将3%琼脂或琼脂糖在水浴中加热至100，至琼脂或琼脂糖完全溶化为止，然后冷却至48。将1份琼脂或琼脂糖与1份新配制的预热至48的2生长培养液混合，使培养基的最终浓度为1生长培养基。4.2制备染色液4.2.1用于琼脂覆盖法的活体染色液的制备4.2.1.11%中性红存贮液制备称取中性红1g,用PBS液100mL溶解。置棕色瓶内，4冰箱贮存。4.2.1.2活体染色液的制备临用前制备活体染色液，用0.01mol/几磷酸盐缓冲溶液将1%水溶性中性红存贮液稀释成0.01%。中性红溶液应避光保存。4.2.2用于分子滤过法的染色液的制备4,2.2.1琥珀酸脱氢酶染色液可选择以下两种方法制备號珀酸脱氢酶染色液：4.2.2.1.1用1mL琥珀酸盐液，9mL氯化氨蓝四唑溶液及1mL甲基豌酸吩嗪液混合制备染色液。各存贮液的制备如下：a)琥珀酸盐液：號珀酸钠13.6g,pH7.6的磷酸盐缓冲液100mL:b)氯化氨蓝四唑溶液：氯化氮蓝四唑溶液100mg,pH7.6的磷酸盐缓冲液100mL,)甲基硫酸吩嗪液：甲基硫酸吩嗪4g,新配制的去离子水10mL。4.2.2.1.2號珀酸钠0.06mol/1.4.0mL磷酸缓冲液0.2 mel/L4.0mL;林格氏液2.0mL;氯化氨蓝四唑(Nitro BT)0.2%10mL.注：磷酸盐缓冲液(pH=7.2士2)：膜酸二氢钠0.2mol/几28mL:磷酸氢二钠0.2mol/几72mL.4.2.2.2非特异性水解酶染色液用非特异性水解酶染色时，制备双酷酸盐荧光素存贮液，即在1L丙酮液中加人5mg双醋酸盐荧光素。使用时取20L存贮液加人到100mL磷酸盐缓冲液中。5设备5.1培养皿：直径90mm的组织培养皿（琼脂覆盖法）：直径5060mm的培养皿（分子滤过法）。5.2二氧化碳恒温培养箱。5.3超净工作台。5.4恒温水浴箱(100)。5.5倒置光显微镜（琼脂覆盖法用）。5.6直径47mm,孔径0.454m的乙酸纤维素滤膜（分子滤过法用）。6样本制备6.1试样6.1.1按厂家要求制备试样。按照GB16886.5第4章的规定对材料浸提液或试样进行试验。在分子滤过法试验中，所有试样包括固体，均应放在滤膜上，试样的重量不大于3.5g。6.1,2固体材料：制成直径约5mm,厚约2mm的圆片。一面光滑以保证与覆盖的琼脂（琼脂覆盖法）2