基于16S_rRNA测序研...硬化小鼠肠道菌群结构的影响_肖刘成.pdf

中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 848 基于16S rRNA测序研究小陷胸汤对动脉粥样 硬化小鼠肠道菌群结构的影响肖刘成1,2，曾思宇1，陈伟业1，贺美燕3，王慧颖1，范崇源1，谢雪姣1,3（1湖南中医药大学，长沙 410200；2常德市第一中医院，常德 415099；3郴州市第一人民医院，郴州 423099）摘要：目的：观察小陷胸汤对动脉粥样硬化小鼠肠道菌群的影响。方法：将30只雄性ApoE-/-小鼠随机分为空白对照组（n=6）和造模组（n=24）。喂养8周后，将造模组小鼠随机分为模型组、阿托伐他汀组、小陷胸汤原方组、小陷胸汤方剂组，每组6只。空白对照组与模型组小鼠给予等量无菌0.9%氯化钠溶液，阿托伐他汀组小鼠给药剂量为2.6 mgkg-1d-1，小陷胸汤原方组给药剂量为16.5 gkg-1d-1，小陷胸汤方剂组给药剂量为 5 gkg-1d-1。连续给药8周后取材。用油红O染色、HE染色检测主动脉根部斑块含量，基于16S rRNA基因测序技术分析小鼠肠道菌群。结果：与模型组比较，小陷胸汤原方组、方剂组主动脉根部斑块减少（P0.01）；小陷胸汤可以正向调节AS小鼠肠道菌群的2种差异菌门（拟杆菌门，厚壁菌门）与8种差异菌属（Alistipes属、毛螺菌 科-NK4A136-group、拟普雷沃菌属、拟杆菌属、Muribaculum属、罗氏菌属、瘤胃球菌科UCG组014属、普雷沃氏科UCG组001属）。结论：小陷胸汤对AS小鼠具有防治作用，该作用可能改善AS小鼠肠道菌群失调来实现的。关键词：动脉粥样硬化；小陷胸汤；16S rRNA技术；肠道菌群；斑块基金资助：国家自然科学基金项目（No.81603600），湖南省教育厅科学研究项目（No.19K069）Effects of Xiaoxianxiong Decoction on intestinal flora structure of atherosclerosis mice based on 16S rRNA sequencingXIAO Liu-cheng1,2,ZENG Si-yu1,CHEN Wei-ye1,HE Mei-yan3,WANG Hui-ying1,FAN Chong-yuan1,XIE Xue-jiao1,3(1Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410200,China;2Changde First Hospital of Traditional Chinese Medicine,Changde 415099,China;3Chenzhou First Peoples Hospital,Chenzhou 423099,China)Abstract:Objective:To observe the effects of Xiaoxianxiong Decoction on intestinal flora of atherosclerosis(AS)mice.Methods:Thirty male ApoE-/-mice were randomly divided into a blank control group(n=6)and a modeling group(n=24).After 8 weeks of feeding,the modeling group were randomly divided into a model group,atorvastatin group,Xiaoxianxiong Decoction original formula group and Xiaoxianxiong Decoction formula group,with 6 rats in each group.The blank control group and model group were given the same amount of sterile 0.9%sodium chloride solution.The dose of atorvastatin group mice was 2.6 mgkg-1d-1,the dose of Xiaoxianxiong Decoction original group was 16.5 gkg-1d-1,and the dose of Xiaoxianxiong Decoction group was 5 gkg-1d-1.The materials were drawn after 8 weeks of continuous administration.The plaque content of aortic root was detected by oil red O staining and HE staining,and the intestinal flora of mice was analyzed based on 16S rRNA gene sequencing technology.Results:Compared with the model group,the plaque of aortic root in Xiaoxianxiong Decoction group and formula group decreased;Xiaoxianxiong Decoction can positively regulate 2 different bacteria(Bacteroidetes,Firmicutes)and 8 different bacteria(Alistipes,Lachnospiraceae_NK4A136_group,Alloprevotella,Bacteroides,Roseburia,Muribaculum,Ruminococcaceae_UCG-014,Prevotellaceae_UCG-001)in the intestinal flora of AS mice.Conclusion:Xiaoxianxiong Decoction has a preventive and therapeutic effect on AS mice,which may be achieved by improving the imbalance of intestinal flora in AS mice.Key words:Atherosclerosis;Xiaoxianxiong Decoction;16S rRNA technology;Intestinal flora;PlaqueFunding:National Natural Science Foundation of China(No.81603600),Scientific Research Project of Hunan Provincial Department of Education(No.19K069)研究报告通信作者：范崇源，湖南省长沙市岳麓区湖南中医药大学，邮编：410200，E-mail：谢雪姣，湖南省长沙市岳麓区湖南中医药大学，邮编：410200，E-mail：内文2.indd 8482023/2/28 10:36:33中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 849 动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种涉及炎症和代谢途径的复杂疾病，是诸多疾病及心脑血管事件的主要发病基础1-2，AS引起的心脑血管疾病已成为非传染性疾病中首要威胁人类健康的疾病。研究3-4发现，人体肠道菌群及其代谢产物与AS存在密切的联系。肠道菌群是人体肠道内的正常微生物，具备免疫、代谢、维持黏膜屏障等多种功能5，近年来，临床与实验研究均证明中药在调节肠道菌群结构，改善肠道屏障功能障碍，降低机体慢性炎症从而抗AS方面具有不良反应少、防治结合等优势6，故被广泛应用于调控肠道菌群抗AS的防治中。小陷胸汤出自于伤寒论，由瓜蒌实、黄连、半夏3味药组成，具有清热化痰、宽胸散结的功效，主治痰热互结的小结胸病。现代多将小陷胸汤应用于消化、呼吸、心血管及代谢等多系统疾病的治疗7，疗效显著，安全性高。本研究则利用16S测序技术研究使用小陷胸汤治疗ApoE-/-小鼠AS过程中肠道菌群的变化情况，试从肠道微生物角度阐释小陷胸汤治疗AS的作用 机制。材料与方法1.动物 SPF级雄性C57BL/6J ApoE-/-小鼠30只，5周龄，体质量1922 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2016-0006。动物饲养于湖南中医药大学实验动物中心，SPF级屏障环境，室温2125，湿度40%50%，光照时间7：0017：00，自由进食饮水。实验室使用许可证号：SYXK（湘）2019-0009。本实验经湖南中医药大学实验伦理委员会批准（伦理审批号：LLBH-201907200016），实验严格遵循实验动物管理条例的相关规定，科学利用，合理保护实验动物。2.药物与制备 小陷胸汤原方组：根据伤寒论原文 138条“黄连一两，半夏半升（洗），瓜蒌实大者一枚”，参照目前通用的经方剂量折算方法，黄连一两约为15.6 g，半夏半升约42 g，瓜蒌实大者一枚约为70 g；小陷胸汤方剂组：根据十四五规划教材方剂学祛痰剂清热化痰剂中剂量，黄连6 g、法半夏12 g、瓜蒌实20 g；中药饮片均购自湖南中医药大学附属第一医院。先将药物加入超纯水中浸泡20 min，再将药物放在电热套中煎煮两次，第1次煎煮加入药物总量8倍量的水，煮沸后小火慢熬1 h，过滤。第2次煎煮加入药物总量6倍量水，煮沸后小火慢熬40 min，过滤。小陷胸汤原方组滤液浓缩至含生药量为 1.65 g/mL浓缩液，小陷胸汤方剂组滤液浓缩至含生药量为 0.5 g/mL浓缩液，20 储存备用。阿托伐他汀钙片（规格：10 mg，乐普制药科技有限公司）购于湖南中医药大学附属第一医院；将阿托伐他汀钙片研磨成粉末状，电子天平上称取13 mg研磨的细粉，加超纯水定容至 50 mL，用玻璃棒搅拌充分混匀，相当于药液浓度为0.26 mg/mL。3.试剂与仪器 DNeasy PowerSoil Kit（QIAGEN公司，批号：12888）；Qubit dsDNA Assay Kit（Life Technologies公司，批号：Q32854）；Tks Gflex DNA Polymerase（Takara公司，批号：R060B）。台式高速离心机（Eppendorf公司，型号：Centrifuge 5418）；PCR仪（Bio-rad，型号：580BR10905）；凝胶成像仪（Tanon公司，型号：2500）。4.模型制备 将30只雄性ApoE-/-小鼠分笼饲养，实验前所有小鼠适应性喂养1周，按体质量随机选择6只小鼠作为空白对照组，以普通饲料喂养，剩余24只小鼠为造模组，饲喂高脂饲料（1%胆固醇+10%猪油+10%蛋黄粉+0.2%猪胆盐+78.8%基础饲料），喂养8周。5.分组与给药 将造模组小鼠按体质量随机分为模型组、阿托伐他汀组、小陷胸汤原方组、小陷胸汤方剂组，每组6只。空白对照组与模型组小鼠给予等量无菌0.9%氯化钠溶液，阿托伐他汀组小鼠给药剂量为2.6 mgkg-1d-1，小陷胸汤原方组给药剂量为16.5 gkg-1d-1，小陷胸汤方剂组给药剂量为 5 gkg-1d-1。以上给药剂量均按中药药理实验方法学中人和动物体表面积换算法计算所得。连续给药8周，给药阶段所有小鼠均普通饲料喂养。6.样本的采集 在末次给药24 h后，收集小鼠心脏纵轴垂直方向切下心尖处约1/3的组织，剩余组织保存于4%多聚甲醛中；取小鼠结肠内容物于无菌