基于“温通心阳”功效的桂枝...损伤模型保护作用的实验研究_栾飞.pdf

年 月第 卷第 期.，.，收稿日期 基金项目 国家自然科学基金面上项目（）通信作者曾南，教授，博士生导师，主要从事中药药理学与毒理学研究，：作者简介 栾飞，博士，主要从事中药心血管药理学研究，：药理 基于“温通心阳”功效的桂枝和肉桂配方颗粒对大鼠心肌缺血 再灌注损伤模型保护作用的实验研究栾飞，雷紫琴，彭利霞，饶志粒，杨若聪，曾南，（成都中医药大学 西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都；成都中医药大学 药学院，四川 成都）摘要 基于“温通心阳”功效平行观察桂枝配方颗粒（）和肉桂配方颗粒（）对大鼠急性心肌缺血 再灌注损伤（，）的保护作用及潜在机制。只 雄性大鼠按体质量随机分为假手术组（），模型组，桂枝与肉桂配方颗粒各自低、高剂量（.、.）组，每组 只。造模前，各组大鼠每天灌胃给药 次，连续给药 ，组和 组给予等体积生理盐水。末次给药 后，除 组外，其余各组大鼠均采用结扎冠状动脉左前降支制备缺血 、再灌注 的 大鼠模型，假手术组大鼠仅穿针不予结扎，其余处理相同。考察桂枝和肉桂配方颗粒对 大鼠心肌功能、心肌梗死面积、心肌病理学和心肌超微结构的改变、心肌细胞凋亡、心肌损伤标志物及炎症因子的影响。法检测大鼠心肌组织中核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族 结构域蛋白（，）炎症小体、凋亡相关斑点样蛋白（，）、切割型半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（，）、（）、白细胞介素（，）和白细胞介素（，）等基因表达水平。法检测大鼠心肌组织中、和 等蛋白表达水平。桂枝和肉桂配方颗粒预处理均能明显改善 大鼠的心肌功能，减小心肌梗死面积，抑制心肌细胞凋亡，降低血清中乳酸脱氢酶（，）、肌酸激酶 同工酶（，）、天冬氨酸转氨酶（，）和心肌肌钙蛋白（，）的含量。此外，桂枝和肉桂配方颗粒预处理能明显降低 大鼠血清中、白细胞介素（，）和肿瘤坏死因子（，）水平。结果表明，桂枝和肉桂配方颗粒预处理能下调模型大鼠心肌、和下游细胞焦亡相关效应物质如、和 的 表达水平。结果显示，桂枝和肉桂配方颗粒预处理还可下调模型大鼠心肌、和 的蛋白表达。综上所述，桂枝和肉桂配方颗粒均对大鼠 具有明显的心肌保护作用，其机制可能与抑制 信号通路从而减轻心肌炎症反应有关。关键词 桂枝配方颗粒；肉桂配方颗粒；温通心阳；心肌缺血 再灌注损伤；炎症小体；通路；焦亡 ，（，；，）年 月第 卷第 期.，.，（）（）（），（.），（.），（），（），（），（），（），（），（）（），（），（），（），（），（），；（）；：.以急性心肌梗死为代表的缺血性心脏病已成为全球发病率和病死率的主要原因，及时恢复冠状动脉血液供应（再灌注）是减轻因心肌缺血损伤所致心肌细胞丢失的最佳途径。然而，大量临床证据和研究证实，再灌注治疗的有益作用会被恢复的血供一定程度上所抵消，反过来会加重心肌损伤，临床上称之为心肌缺血 再灌注损伤（，）。研究发现心肌炎症、钙离子超载、凋亡、自噬、氧化应激、铁死亡、能量代谢紊乱等广泛参与了 的发生发展。尽管 的发病机制研究已取得一些成果，但目前在能有效防止或减轻 的临床疗法中仍存在不足之处。因此，在明确 的一些分子病理机制上，寻求新的治疗策略如中医药辅助或中西医结合治疗来对抗 是目前临床上亟待解决的重要难题之一。桂枝 和 肉 桂 均始载于神农本草经，分别来源于樟科植物肉桂树的干燥嫩枝和干燥树皮，为不同入药部位。桂枝属于解表药，具有发汗解肌，温通经脉，助阳化气，平冲降气之功效，主治风寒感冒，脘腹冷痛，血寒经闭，关节痹痛，痰饮，水肿，心悸，奔豚等；肉桂属于温里药，具有补火助阳，引火归元，散寒止痛，温通经脉之功效，主治阳痿宫冷，腰膝冷痛，肾虚作喘，虚阳上浮，眩晕目赤，心腹冷痛，虚寒吐泻，寒疝腹痛，痛经经闭等。虽属于中药学中不同类别中药，但两者在药性上具有味辛、性温、入心经之共性，均有“温通心阳”之功效。药理学研究发现，两药均具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒及心血管保护等生物活性；且化学成分研究表明，挥发油、苯丙素类、萜 类、酚 酸 类、木 脂 素 类 等 是 两 者 共 有 成分。此外，临床实践亦发现以桂枝或肉桂为君药的一些复方如桂枝甘草汤、桂枝龙骨牡蛎汤及温经通脉汤等，对心肌缺血性疾病如冠心病、原发性低栾飞等：基于“温通心阳”功效的桂枝和肉桂配方颗粒对大鼠心肌缺血 再灌注损伤模型保护作用的实验研究血压、二尖瓣脱垂综合征、心阳亏虚型心律失常等有效。因此，基于两者基原、功效的共性特征，为进一步挖掘桂枝和肉桂的药用潜能，充分利用传统药物资源，最大限度减少资源浪费，本研究着眼于两药共性“温通心阳”之共性功效，采用冠状动脉左前降支结扎建立 大鼠模型，平行观察桂枝和肉桂对 大鼠心脏功能的保护作用及其潜在作用机制，旨在揭示两药“辛温心”“温通心阳”之“性效”共性的中医科学内涵，同时为两药在临床上治疗心系疾病的相互替代提供现代药理学依据。材料.动物 级雄性 大鼠 只，周龄，体质量 ，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物使用许可证号（川）。大鼠适应性饲养 后开始实验，饲养环境：温度（）、相对湿度，大鼠自由进食饮水。本实验获成都中医药大学动物伦理委员会批准（批准号）。.药品与试剂 桂枝配方颗粒（规格.，相当于饮片.；批号）和肉桂配方颗粒（规格.，相当于饮片.；批号）购自四川新绿色药业科技发展有限公司；，三苯基氯化四氮唑（，批号）购自成都市科隆化学品有限公司；肌酸激酶 同工酶（，）检测试剂盒（批号）、乳 酸 脱 氢 酶（，）检测试剂盒（批号）和天门冬氨酸氨基转移酶（，）检测试剂盒（批号）等购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；肌钙蛋白（，）检测试剂盒（批号）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；白细胞介素（，）、白细胞介素（，）和肿瘤坏死因子（，）检测试剂盒（批号分别为、）均购自上海吉泰依科赛生物科技有限公司；末端脱氧核苷酸转移酶标记（，）细 胞 凋 亡 检 测 试 剂 盒（批 号）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；动物组织 总 提 取 试 剂 盒（批 号）购 自 成 都 福 际 生 物 技 术 有 限 公 司；反转录试剂盒（批号）和 荧光定量预混试剂增强版（批号）购自天根生化科技（北京）有限公司；抗体（批号）购自英国 公司；抗体（批号）购自美国 公司；抗体（批号）购自美国 公司；抗体（批号）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；标记山羊抗兔（批号）购自北京博奥森生物技术有限公司。.仪器 型小动物生物信号采集系统（成都泰盟科技有限公司）；型小动物人工呼吸机（淮北正华生物仪器设备有限公司）；型高分辨小动物超声成像系统（加拿大多伦多 公司）；型透射电子显微镜（日本日立电子公司）；型高速组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）；型动物血液全自动生化测定仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；型高级多功能酶标仪（美国 公司）；型实时荧光定量 仪（美国 公司）；免染型化学发光凝胶成像系统（美国 公司）。方法.动物分组及药物处理 只 级雄性 大鼠按体质量随机分为 组：假手术组（），缺血模型组（），桂枝配方颗粒低、高剂量组（、，.、.）和肉桂配方颗粒低、高剂量组（、，.、.），每组 只。组和 组大鼠手术前每天灌胃给药 次，给药体积为 ，连续灌胃给药 。组和 组分别灌胃等体积生理盐水。末次给药 后，开始进行 手术造模。桂枝、肉桂给药剂量根据中国药典 年版中桂枝和肉桂剂量的描述，按照成人每日 生药用量采用人与大鼠体表面积换算公式得到相应等效剂量即.，将其作为低剂量，设.为高剂量。.大鼠 模型的制备参照文献建立大鼠 模型。大鼠末次给药 后，乌拉坦溶液腹腔注射麻醉，脱毛膏脱毛后，将大鼠仰卧位固定，小动物生物信号系统实时监测大鼠心电图变化，碘伏消毒，行气管插管；小动物呼吸机维持人工呼吸，呼吸频率 次，潮气量 ，呼吸 年 月第 卷第 期.，.，比为 。心电图稳定后，大鼠左前胸脱毛消毒后，手术剪纵行切开胸骨左缘心尖处 皮肤，小心剥离肌肉，打开左胸三四肋暴露心脏，剪开心包膜，在左心耳下缘与肺动脉间可见左冠状动脉前降支起始部，距离主动脉根部 处，以左冠状静脉为标志，用 号无菌带针缝合线在心脏左心耳下缘.处进针，肺动脉圆锥旁出针，将冠状动脉左前降支进行结扎造成心脏缺血。及时观察心脏表面颜色，若出现发绀后立刻送回胸腔并观察心电图变化，导联显示 段抬高或 波高耸，表明心肌缺血模型形成。在缺血 后松开，轻轻拉动结扎线打开活结，使血液流通，恢复心肌再灌注，再灌注损伤成功标志以导联上抬的 段下降 或高耸的 波下降为准，即完成大鼠心肌缺血再灌注损伤模型建立。假手术组大鼠仅穿针不予结扎，其余处理均相同。再灌注 后，超声心动图检测大鼠的心脏功能，然后腹主动脉取血取材后，进行各项指标检测。.超声心动图检测 采用 型高分辨率小动物超声成像系统检测大鼠心脏功能。在左室胸骨旁短轴切面，用超声旋转探头（探头，分辨率 ，频率 ）记录大鼠左心室运动情况，获取 型模式图像并储存，通过软件测定左心室射血分数（，）、左心室缩短分数（，）、左心室收缩末期内径（，）、左心室舒张末期内径（，）、每搏输出量（，）及心率（，次）等变化情况。此实验至少通过检测 个连续、完整的心动周期，以平均值来评估每个参数。.心肌梗死面积测定采用 染色检测大鼠心肌梗死范围。超声结束后大鼠取血，然后分离大鼠心脏，预冷 冲洗心脏内积血，去除血管和脂肪，滤纸吸干。然后于 冰箱冷冻 ，用模具将心脏横切成 厚的切片，浸入 溶液中，恒温避光染色 ，后将心肌切片放入的中性甲醛溶液中再固定 。数码相机拍照后，用 .软件计算心肌梗死面积百分比。心肌梗死面积百分比 心肌梗死区面积之和 心肌横切片面积之和。.染色观察心肌组织病理学改变取结扎部位以下.处心肌组织，中性甲醛固定 后，脱水，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，染色，梯度乙醇脱水，封片，光学显微镜下观察心肌组织形态改变。.透射电镜观察心肌组织超微结构改变取结扎部位以下.处心肌组织，.戊二醛预固定，四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，包埋，半薄切片用甲苯胺蓝染色作光学定位，用钻石刀作超 薄 切 片，醋 酸 铀 和 枸 橼 酸 铅 染 色 后 透射电镜观察。.心肌损伤标志物和炎症因子测定超声结束后，腹主动脉取血，室温静置分层后，室温离心 ，吸取上清。采用动物血液全自动生化测定仪测定大鼠血清中、和 的含量。采用 试剂盒检测大鼠血清中、和 的含量。.细胞凋亡测定 采用 法检测心肌细胞凋亡。剪取约 心肌组织于多聚甲醛中固定，制备石蜡切片，乙醇梯度脱水，石蜡包埋并切片，按 试剂盒说明书进行染色，并用 进行细胞核染色。于荧光显微镜下观察大鼠心肌细胞绿色及蓝色荧光情况，根据心肌细胞凋亡的分布情况，随机选取 个 倍视野进行拍照，使用 .分析软件对 阳性细胞核和总细胞核进行计数，利用两者的比值表示 阳性细胞数百分比作为凋亡率，以此反映细胞凋亡的程度。即细胞凋亡率阳性细胞总数 心肌细胞总数。.实时荧光定量 检测 称取约 心肌组织，采用动物组织总 提取试剂盒提取心肌组织中总，测定总 的纯度。按照逆转录试剂盒说明书将等量总（）反转录为。以 为模板，采用 型实时荧光定量 仪进行 扩增并用熔融法监测特异性曲线分析，反应条件为 ；个循环。相关引物由成都擎科生物技术有限公司设计合成，引物序列见表。使用 方法计算每个基因表达的倍数变化。.检测 超声结束后，每组随机选取 只大鼠，腹主动脉取血后，分离心脏。提取左心栾飞等：基于“温通心阳”功效的桂枝和肉桂配方颗粒对大鼠心肌缺血 再灌注损伤模型保护作用的实验研究 表 引物序列信息 基因引物（）：室心肌组织总蛋白，法测定蛋白浓度，调整各组蛋白浓度。等量蛋白（）进行 凝胶电泳分离，湿法将蛋白转移至 膜上，脱脂奶粉室温封闭 ，接着加入相应的一抗抗体（稀释比例 ），孵育过夜，洗膜，加入 标记的二抗（稀释比例 ）室温孵育。再次洗膜后，在 凝胶成像系统中采用超敏 化学发光液检测蛋白条带，以 为内参，使用 软件对目的条带进行灰度分析，以目的蛋白条带灰度值 灰度值表示目的蛋白相对表达量。.统计学分析 数据均以?表示，采用.软件分析，组间比较采用 检验，多组内比较采用单因素方差分析（），多重比较