基于Cu,Fe-N-C氧化...建邻苯二甲酸酯荧光检测探针_李宏.pdf

306 2023,Vol.44,No.04 食品科学 安全检测基于Cu,Fe-N-C氧化酶活性构建邻苯二甲酸酯荧光检测探针李 宏1,2，史 巧1，陈骏飞1，王馨蕊1，汤回花1，李秋兰2，杨德志2，杨亚玲2,*（1.云南省农业科学院农产品加工研究所，云南 昆明 650221；2.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500）摘 要：基于邻苯二甲酸酯（phthalic acid ester，PAEs）对双金属原子Cu,Fe-N-C纳米酶模拟氧化酶活性的调节，建立简单、灵敏测定发酵食品中PAEs的荧光探针方法。PAEs吸附于Cu,Fe-N-C表面后，会加速Cu,Fe-N-C催化氧化底物邻苯二胺，使生成的2,3-二氨基吩嗪产物荧光强度增加，PAEs在1.2550 g/L范围内呈良好的线性关系。将该研究方法用于PAEs含量的测定，其检出限可达到0.76 g/L，实际样品的加标回收率在88.0%104.6%范围内，满足GB 5009.2712016中的检测要求。该方法具有简便、稳定、快速等特点，其检出限也低于国家规定的食品中PAEs含量的限值。关键词：邻苯二甲酸酯；纳米酶；氧化酶活性；荧光探针A Fluorescent Probe Based on Cu,Fe-N-C Nanozyme with Oxidase-like Activity for Detection of Phthalate EstersLI Hong1,2,SHI Qiao1,CHEN Junfei1,WANG Xinrui1,TANG Huihua1,LI Qiulan2,YANG Dezhi2,YANG Yaling2,*(1.Institute of Agro-products Processing,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming 650221,China;2.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Technology,Kunming 650500,China)Abstract:A simple and sensitive fluorescent probe for the determination of phalic acid ester(PAEs)in fermented foods was developed based on the fact that the oxidase-like activity of Cu,Fe-N-C nanozyme can be regulated by PAEs.After PAEs were adsorbed on the surface of Cu,Fe-N-C,the catalytic oxidation of the substrate o-phenylenediamine(OPD)was accelerated,thus increasing the fluorescence intensity of the generated 2,3-diaminophenazine(DAP).The calibration curve for PAEs showed a good linear relationship in the concentration range of 1.2550 g/L.The detection limit of the proposed method was 0.76 g/L.The recoveries of spiked samples ranged from 88.0%to 104.6%,which meet the detection requirements of the national standard GB 5009.271-2016.This method is simple,stable and rapid,and its detection limit is lower than the national limit for PAEs content in foods.Keywords:phthalic acid esters;nanozyme;oxidase-like activity;fluorescent probeDOI:10.7506/spkx1002-6630-20211213-143中图分类号：TS255.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）04-0306-07引文格式：李宏,史巧,陈骏飞,等.基于Cu,Fe-N-C氧化酶活性构建邻苯二甲酸酯荧光检测探针J.食品科学,2023,44(4):306-312.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20211213-143.http:/ LI Hong,SHI Qiao,CHEN Junfei,et al.A fluorescent probe based on Cu,Fe-N-C nanozyme with oxidase-like activity for detection of phthalate estersJ.Food Science,2023,44(4):306-312.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20211213-143.http:/收稿日期：2021-12-13基金项目：云南省重大科技专项（202002AE320006）第一作者简介：李宏（1974）（ORCID:0000-0002-0877-8867），男，研究员，硕士，研究方向为农产品加工。E-mail:*通信作者简介：杨亚玲（1964）（ORCID:0000-0003-0115-7563），女，教授，博士，研究方向为分析化学。E-mail:邻苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs）是一个化合物系列，主要用于生产柔性聚氯乙烯或乙烯基产品，是最常用的塑化剂之一。PAEs与塑料主体以分子间相互作用力的形式结合，较易转移到各种环境中，对空安全检测 食品科学 2023,Vol.44,No.04 307气、土壤、水源甚至食品造成污染1-3。PAEs是一种环境激素类物质，可在生物体内富集而产生毒性作用，引起肝脏、免疫、生殖内分泌和胚胎发育毒性等，严重威胁人们的身体健康4-6。我国在2016年发布了关于PAEs的食品国家标准，对食品中PAEs含量限制范围作出明确规定7-8。目前，PAEs检测主要有气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用技术、高效液相色谱-质谱联用技术、近红外光谱分析技术、荧光光谱法以及实时荧光定量聚合酶链式反应技术等9-15。荧光光谱法具有检测便捷、灵敏度高、重现性好、强选择性等优势16，但由于PAEs分子本身不能发出荧光17-18，各种PAEs的荧光检测主要集中在对PAEs进行衍生，通过间接荧光 法检测PAEs19-20。自2007年我国科学家阎锡蕴发现四氧化三铁磁性纳米颗粒本身具有类过氧化物酶的催化活性以来21，纳米酶的研究得到快速发展，由于其稳定性高、易于生产及成本低，可作为天然酶的替代品等优势，成为研究 热点22-23。其中单原子纳米酶由于与天然金属酶的M-Nx位点相似，表现出优异的催化活性及选择性，受到广泛关注24，在单原子纳米酶中引入第2个过渡金属原子，可以改善酶活性，提高对底催化的选择性25-27。本研究利用热解法合成了铜、铁双原子纳米酶（Cu,Fe-N-C），基于PAEs调节Cu,Fe-N-C氧化物模拟酶活性，建立荧光检测新方法。如图1所示，Cu,Fe-N-C能催化邻苯二胺（o-phenylenediamine，OPD）生成黄色荧光产物2,3-二氨基吩嗪（2,3-diaminophenazine，DAP）。而PAEs的加入会增强催化体系的荧光强度，由此建立痕量PAEs的荧光探针检测方法。邻苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）、邻苯二甲酸二辛酯（dioctyl phthalate，DOP）、邻苯二甲酸二壬酯（dinonyl phthalate，DINP）5 种PAEs类物质有此现象，该方法检测这5 种PAEs的总量。OPDOPD:DAP:PAEs:NH2NH2OOORORNH2NNNH2DAPPAEsCu,Fe-N-C图 1 PAEs检测示意图Fig.1 Schematic diagram of PAE detection1 材料与方法1.1 材料与试剂酱腌菜样品，购自云南昆明市呈贡区超市。DMP、DEP、DBP、DOP、DINP、（分析纯，纯度99%）中国医药集团上海化学试剂公司；氯化铜（CuCl2）、氯化铁（FeCl3）、中-四(4-羧基苯基)卟吩、甲醇、3,3,5,5-四甲基联苯胺（3,3,5,5-tetramethylbenzidine，TMB）、OPD、2,2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）上海阿拉丁生化科技股份有限公司。1.2 仪器与设备GS800A分子荧光光谱仪 安捷伦科技（中国）有限公司；UV-2600紫外-可见分光光度计 岛津（上海）实验器材有限公司；Tecnai G2 TF30场发射透射电子显微镜 荷兰FEI公司；X射线衍射仪、TENsoR27型傅里叶红外光谱分析仪 德国Bruker公司；XW-800快速混匀器 上海汗诺仪器有限公司；HC-3018R型高速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；高温管式炉 上海贝克有限公司；电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；pHS-3B精密酸度计 赛多利斯（上海）贸易有限公司；78-1型磁力加热搅拌器 上海南汇电讯器材厂；AB204-S电子分析 天平 梅特勒-托利多科技（中国）有限公司。1.3 方法1.3.1 Cu,Fe-N-C材料的制备参照Lin Zhen28和Huang Xuemin29等的研究进行改进。对配体分子的筛选，材料制备方法如下：10 mL甲醇中含有2.636 g CuCl2作为溶液A，20 mL甲醇中含有5 g中-四(4-羧基苯基)卟吩和2.376 g FeCl3（按Cu、Fe物质的量比1 1计算得到）作为溶液B，将A和B两种溶液均匀混合并80 烘箱干燥老化2 h。得到的墨绿色干燥粉末称取5 g于石英舟中，管式炉750 在N2保护下煅烧2 h得到黑色粉末。粉末于硫酸溶液（H2SO4 H2O=1 9，V/V）中12 h浸泡后用水反复冲洗。干燥后，后续用实验用水配制成质量浓度为0.5 mg/mL的悬浮液使用。1.3.2 PAEs的检测以DMP为PAEs的模式物，在EP管中依次加入100 L Cu,Fe-N-C和50 L 100 mmol/L OPD，一定质量浓度的DMP标准溶液，2 mL pH 8.0磷酸盐缓冲溶液，充分混匀，室温孵育10 min后，于8 000 r/min离心3 min，取上层清液在421 nm激发波长下，564 nm发射波长处测定荧光强度。设定I=II0，I表示加入DMP后溶液的荧光强度；I0表示未加入DMP作空白时溶液的荧光强度。308 2023,Vol.44,No.04 食品科学 安全检测1.3.3 Cu,Fe-N-C材料酶活性的测定采用TMB及ABTS显色反应测定Cu,Fe-N-C纳米酶的活性。首先，将100 L Cu,Fe-N-C、100 mmol/L的TMB及ABTS各50 L，加入到2 mL pH 4.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液，充分混匀，室温孵育10 min后，于8 000 r/min离心3 min，取上层清