基于CRISPR_Cas1...LK融合基因检测方法的建立_邹赛.pdf

第 33 卷第 1 期2023 年 2 月生物技术Biotechnology33(1):19Feb.,2023 收稿日期:2022-02-11 基金资助:全军卫勤保障能力创新与生成专项(20WQ029);全军保健专项科研课题(18BJZ14);广东省医学科学技术研究基金项目(A2021273)作者简介:邹赛(1997-),女,湖南省岳阳人,学士,检验师,研究方向:肿瘤分子标志物快速诊断,E-mail:784753475 。通讯作者:李林海(1972-),男,云南省大理人,博士,教授,博导,研究方向:肿瘤分子标志物及细胞信号转导学,发表论文 100 余篇,E-mail:。技术与方法TECHNIQUE AND METHOD基于 CRISPR/Cas13a 的 EML4-ALK 融合基因检测方法的建立邹赛1,2,肖斌3,邝振展4,孙朝晖1,黄秀娜1,李林海3(1.中国人民解放军南部战区总医院 检验科,广东 广州 510010;2.珠海市妇幼保健院 检验科,广东 珠海 519000;3.广州医科大学附属第六医院,清远市人民医院 检验医学部,广东 清远 511518;4.深圳大学附属华南医院 检验科,广东 深圳 518000)摘要:目的构建基于 CRISPR/Cas13a 蛋白的 SHERLOCK 技术平台,并将其应用于肺癌 EML4-ALK 融合基因的检测。方法构建 EML4-ALK 融合基因的质粒标准品;利用 RPA 和 PCR 技术分别扩增目的基因后进行 SHERLOCK 检测并比对结果,比较基于 RPA 和 PCR 扩增的 SHERLOCK 检测 EML4-ALK 融合基因的灵敏度,评估 SHERLOCK 检测目的基因及多种非目标基因的特异性。结果成功构建 EML4-ALK 融合基因表达质粒标准品;基于 RPA 和 PCR 扩增的 SHERLOCK 检测 EML4-ALK 融合基因的相对荧光值无显著差异,最低检测下限为10 copies/L,且在5 min 内荧光达到平台期;SHERLOCK 技术仅对 EML4-ALK 融合基因有阳性检测信号,对 EML4、ALK、EGFR T790M 和 EGFRL858R 基因无阳性检测信号。结论基于 SHERLOCK 技术的 EML4-ALK 融合基因检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测时间短等优势,有望为肺癌 EML4-ALK 融合基因的早期诊断提供重要依据。关键词:Cas13a 蛋白;SHERLOCK 技术;EML4-ALK;基因检测中图分类号:R446.7 文献标识码:A DOI:10.16519/ki.1004-311x.2023.01.0004Establishment of a novel method in detecting EML4-ALKfusion gene based on CRISPR/Cas13aZOU Sai1,2,XIAO Bin3,KUANG Zhen-zhan4,SUN Zhao-hui1,HUANG Xiu-na1,LI Lin-hai3(1.Department of Clinical Laboratory,General Hospital of the Southern Theater of the Chinese Peoples LiberationArmy,Guangzhou 510010,China;2.Department of Clinical Laboratory,Clinical Laboratory of Zhuhai Maternaland Child Health Hospital,Zhuhai 519000,China;3.Department of Laboratory Medicine,the Sixth AffiliatedHospital of Guangzhou Medical University,Qingyuan Peoples Hospital,Qingyuan 511518,China;4.Department of Clinical Laboratory,South China Hospital Affiliated to Shenzhen University,Shenzhen 518000,China)Abstract:Objective The SHERLOCK technology platform based on CRISPR/Cas13a protein was constructed and appliedto the detection of EML4-ALK fusion gene in lung cancer.MethodConstructing plasmid standard of EML4-ALK fusiongene.After the target genes were amplified by RPA and PCR techniques,SHERLOCK detection was performed to compare thesensitivity of SHERLOCK based on RPA and PCR amplification and to evaluate the specificity of SHERLOCK detection of tar-get genes and various non-target genes.ResultThe standard EML4-ALK fusion gene expression plasmid was successfullyconstructed.SHERLOCK based on RPA and PCR amplification showed no significant difference in the relative fluorescence val-ue of EML4-ALK fusion gene,with a minimum detection limit of 10 copies/L and a plateau in fluorescence within 5 min.SHERLOCK technique only had positive detection signal for EML4-ALK fusion genes,but had no positive detection signal forEML4-ALK,EGFR T790M and EGFR L858R genes.Conclusion The EML4-ALK fusion gene detection method based onSHERLOCK technology has the advantages of strong specificity,high sensitivity and short detection time,and is expected to pro-vide an important basis for the early diagnosis of EML4-ALK fusion gene in lung cancer in lung cancer.Keywords:Cas13a protein;SHERLOCK technology;EML4-ALK;genetic testing EML4-ALK(The echinoderm microtubuleassoci-ated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase)融生 物 技 术2023 年合基因是首个被发现的高特异性肺腺癌驱动基因1,该基因可促使细胞获得恶性转化和致瘤能力2。EML4-ALK 融合基因在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的发生率为6.8%(472/6950)3,但由于 NSCLC 的发病率逐年增加,EML4-ALK 阳性患者数量依然不可忽视。目前,针对 EML4-ALK 融合基因的靶向药克唑替尼在 EML4-ALK 阳性 NSCLC 患者中的临床受益率超过 80%,6 个月的无进展生存率(Progress Free Survival,PFS)为 72%4;因此,建立快速有效的 EML4-ALK 融合基因检测方法,对肺癌的早期诊断以及指导用药具有重要意义。目前,针对 EML4-ALK 融合基因的检测方法包括实时 qPCR 技术、第二代 DNA 测序技术(Next-generation sequencing,NGS)、扩增阻碍突 变 系 统(amplification refractory mutation system,ARMS)和荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)等5。其中,qPCR 技术是 EML4-ALK 融合基因最常见的临床检测技术,具有敏感、特异、半定量等优点,也存在着易污染、检测时间长等不足6;其他方法成本较高,通常需要较长的检测时间6-7。因此,临床急需一种快速准确检测 EML4-ALK 融合基因的方法。特异性高灵敏度酶报告系统(Specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking,SHERLOCK)技术利用重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymer-ase amplification,RPA)技术在恒温条件下快速扩增核酸,结合成簇规律间隔短回文重复序列及其相关基因(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR associated gene,CRISPR/Cas)系统中 Cas13a 蛋白的生物特性,在 crRNA(CRISPR-de-rived RNA)的引导下特异性切割靶 RNA,同时切割荧光报告分子发出荧光8。该技术可以快速、低成本、高灵敏度地检测临床样本中的 DNA 或 RNA。目前,SHERLOCK 技术已成功应用于新型呼吸道病毒SARS-CoV-2、寨卡病毒和登革热病毒等病原微生物的快速检测9-11。此外,SHERLOCK 在表皮生长因子受体 L858R、鼠类肉瘤病毒癌基因同源物 B1V600E 等肿瘤突变基因检测中也发挥重要作用12。然而,SHERLOCK 技术在肿瘤融合基因检测中的应用尚未见报道。本研究拟联合利用 Cas13a 的生物学特性和RPA 的技术优势,建立一种基于 SHERLOCK 技术的快速准确高效检测 EML4-ALK 融合基因的方法,为肺癌的早期诊断和靶向治疗提供依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料EML4 基因质粒、ALK 基因质粒、EGFR T790M基因质粒、EGFR L858R 质粒由笔者课题组先前构建并保存于-80 冰箱,测序和 Blast 结果如图 1所示。图 1 各质粒的测序和 Blast 结果注:A:L858R;B:EML4;C:ALK;D:T790M。Fig.1 Sequencing and blast results of all plasmidsNote:A:L858R;B:EML4;C:ALK;D:T790M.02 1 期邹赛,等:基于 CRISPR/Cas13a 的 EML4-ALK 融合基因检测方法的建立1.1.2 试剂Cas13a 蛋白、RNA 荧光探针、crRNA 购自于中国广州博徕斯生物公司。引物购自于中国广州四和生物。qPCR 试剂(RR420A)、高保真聚合酶(R045A),T4 连接酶(6024)、Xho(1635)、Kpn(1618)限制酶来自于日本 Takara 生物。TwistAmp Basic RPA 试剂盒(TABAS03KIT-96t)来自于英国 FAPAS 公司。本文所用的引物、