GB∕T 38488-2021 微生物快速测定方法.pdf

书 书 书犐 犆犛 犆犆犛犃 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准犌犅犜 微生物快速测定方法犚犪 狆 犻 犱犱 犲 狋 犲 狉犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犿 犻 犮 狉 狅 狅 狉 犵 犪 狀 犻 狊犿狊 发布 实施国 家 市 场 监 督 管 理 总 局国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发 布书 书 书前言本文件按照 标准化工作导则第部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国标准化研究院提出并归口。本文件起草单位：北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国标准化研究院、天津海关工业产品安全技术中心、江汉大学、北京工商大学、武汉旭东食品有限公司、北京萨姆伯科技有限公司、华测检测认证集团北京有限公司、中国农业大学。本文件主要起草人：张捷、马爱进、柳明、赵琢、彭海、畅晓晖、张园、贾英民、高欣、杨向莹、张惠媛、何旭东、郝帅、李小林、董立雅、张昊、王华、陈广全、彭彦昆。犌犅犜 微生物快速测定方法范围本文件规定了用分子马达法、近红外免疫层析法和目标区域测序法快速测定微生物的方法。本文件中第一法 分子马达法适用于食品和生活饮用水中单核细胞增生李斯特氏菌（犔犿狅 狀 狅 犮 狔 狋 狅 犵 犲 狀 犲 狊）、副溶血性弧菌（犞 犻 犫 狉 犻 狅狆犪 狉 犪 犺 犲犿狅 犾 狔 狋 犻 犮 狌 狊）、霍乱弧菌（犞 犻 犫 狉 犻 狅犮 犺 狅 犾 犲 狉 犪 犲）、沙门氏菌（犛犪 犾犿狅 狀 犲 犾 犾 犪）、阪崎克罗诺杆菌（阪崎肠杆菌）（犆 狉 狅 狀 狅 犫 犪 犮 狋 犲 狉狊 犪 犽 犪 狕 犪 犽 犻 犻）、志贺氏菌（犛犺 犻 犵 犲 犾 犾 犪）、甲型肝炎病毒（犎犲 狆犪 狋 犻 狋 犻 狊犃狏 犻 狉 狌 狊，犎犃犞）的快速测定；第二法 近红外免疫层析法适用于食品和生活饮用水中单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、沙门氏菌、轮状病毒（犚狅 狋 犪 狏 犻 狉 狌 狊）、诺如病毒（犖狅 狉 狅 狏 犻 狉 狌 狊）、甲型肝炎病毒的快速测定；第三法 目标区域测序法适用于食品和生活饮用水中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌（犛 狋 犪狆犺狔 犾 狅 犮 狅 犮 犮 狌 狊犪 狌 狉 犲 狌 狊）、副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶耳森氏菌（犢 犲 狉 狊 犻 狀 犻 犪犲 狀 狋 犲 狉 狅 犮 狅 犾 犻 狋 犻 犮 犪）、空肠弯曲菌（犆犪犿狆狔 犾 狅 犫 犪 犮 狋 犲 狉犼 犲 犼 狌 狀 犻）、单核细胞增生李斯特氏菌、肠出血性大肠杆菌 ：（犈狀 狋 犲 狉 狅 犺 犲犿狅 狉 狉 犺 犪犵 犻 犮犈犮 狅 犾 犻 ）、霍乱弧菌、阪崎克罗诺杆菌（阪崎肠杆菌）、创伤弧菌（犞 犻 犫 狉 犻 狅狏 狌 犾 狀 犻 犳 犻 犮 狌 狊）和溶藻弧菌（犞 犻 犫 狉 犻 狅犪 犾 犵 犻 狀 狅 犾 狔 狋 犻 犮 狌 狊）的快速测定。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。分子马达法 原理合成酶属于一种旋转型分子马达，由跨膜质子（）梯差驱动，其上的亚基为转子，转子负载越大，分子马达转速越低、跨膜转运的质子（）数量越少。在合成酶的亚基上连接亚基抗体链霉亲和素生物素核酸探针（见附录表），当探测到目标病原微生物特异性基因序列并与其结合时，分子马达的转速变化可以间接地通过载色体（）膜外标记的对敏感的荧光探针，双十六烷基 甘油磷酸乙醇胺（）来检测，从而实现对目标病原微生物的定性测定。试剂和材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水：中一级水。提取试剂盒。犌犅犜 提取试剂盒。分子马达检测试剂盒：见表。荧光素酶溶液：将荧光素酶荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶荧光素的棕色玻璃瓶中，盖上瓶塞反复颠倒混匀，不可振荡。异硫氰酸胍溶液：。阳性对照：以标准菌株或病毒提取，作为阳性对照。阴性对照：以不含目标微生物的样品，提取，作为阴性对照。仪器设备 恒温水浴锅：。涡旋振荡器。离心机：犵。移液器：单道，；多道 。电子天平，感量 。荧光光谱仪：配备 孔板及相应装置。离心管：。病原菌 操作步骤 样品制备、增菌培养和分离见附录。犇犖犃提取挑取可疑菌落，用提取试剂盒进行提取，所得菌体提取液作为样品待测液。制备好的样品应尽快进行检测。若暂时不能进行检测，应置于冰箱中 保存，使用时置于室温自然解冻，涡旋振荡混匀。犇犖犃变性取 中的样品待测液 分别加入个 离心管，置于恒温水浴锅中，沸水浴中加热，立刻转移到冰浴中，静置冷却。配制反应体系 分别取病原菌分子马达探针溶液（见表），用合成缓冲液（见表）稀释到一定的倍数。取稀释后的分子马达探针溶液 分别加入 的各离心管中。向 的各离心管中加入 启动缓冲液（二磷酸腺苷和合成缓冲液按体积比混合配制），涡旋振荡混匀，立即离心去除管盖内壁上的水珠，放入 恒温摇床中温育 。取出离心管后分别加入 缓冲液（见表），涡旋振荡混匀，形成最终反应体系。加样与测定用无菌水代替样品待测液，其他步骤不变制备空白对照。用无菌水代替样品待测液，不加入分子马达探针，其他步骤不变制备本底对照。将 处理后的最终反应体系、空白对照及本底对照分别加入洁净的 孔板中，每个反应体系加个孔，空白对照和本底对照各加个孔，每孔。每孔分犌犅犜 别加入 荧光素酶溶液（），用移液器混匀各孔溶液。荧光光谱仪设定激发波长为 ，发射波长为 ，测定各孔荧光度值（值），用最终反应体系荧光度值减去本底荧光度值和空白对照荧光度值即为样品的实际荧光度值。结果及判定 结果计算荧光差值按式（）计算：犉犅犅犅犅犅 （）式中：犉 荧光差值；犅 样品荧光度值；犅 空白对照荧光度值；犅 本底对照荧光度值。结果分析将样品荧光度值绝对值与的空白对照荧光度值绝对值进行单因素方差分析，若差异显著（狆 ）则表示检出该基因。结果判定两次样品荧光差值平均值大于，则结果判定为阳性；两次样品荧光差值平均值小于或等于，则结果判定为阴性。本方法判定为阳性结果的样品，宜参照附录中的方法或相关国际权威微生物经典检验方法进行阳性结果确证。病毒 操作步骤 提取见附录。犚犖犃提取向 的沉淀中加入 的异硫氰酸胍溶液，涡旋振荡使沉淀充分溶解，使用试剂盒进行提取，所得病毒提取液作为样品待测液。制备好的应尽快进行检测。若暂时不能进行检测，应置于 保存备用。犚犖犃变性取 中的样品待测液 加入 离心管，置于恒温水浴锅中 水浴，立即转移至 水浴静置。配制反应体系取病毒分子马达探针溶液（见表），其他操作步骤同 。加样与测定用无菌水代替样品待测液，其他步骤不变制备空白对照。用无菌水代替样品待测液，不加入分子马犌犅犜 达探针，其他步骤不变制备本底对照。将 处理后的最终反应体系、空白对照及本底对照按照 步骤进行加样与测定。结果及判定 结果计算检测结果按式（）计算。结果判定两次样品荧光差值平均值大于，则结果判定为阳性；两次样品荧光差值平均值小于或等于，则结果判定为阴性。本方法判定为阳性结果的样品，宜参照附录中的方法或相关国际权威微生物经典检验方法进行阳性结果确证。近红外免疫层析法 原理利用近红外荧光染料标记抗体，双抗体夹心免疫层析原理制备试纸条。在抗体垫上固定有近红外荧光标记的抗致病菌或病毒单克隆抗体和作为质控物的近红外荧光标记的鸡 多克隆抗体。当含有致病菌或病毒的样品滴加到试纸条样品垫上后，靶标致病菌或靶标病毒与抗体垫上的标记抗体结合，形成荧光标记物标记抗体靶标分子复合物。复合物随溶液向试纸条前端迁移，当复合物迁移至检测线时，被固定于检测线上的抗致病菌或病毒抗原的另一株单克隆抗体所捕获。荧光标记的鸡 多克隆抗体随溶液继续迁移，到达质控线时被固定于质控线上的山羊抗 多克隆抗体所捕获。利用便携式低噪声激发式荧光扫描仪分别扫描质控线和检测线，以检测线与质控线荧光强度比值与阈值进行比较，大于或等于阈值判断为阳性，小于阈值判断为阴性。试剂和材料 磷酸缓冲盐溶液（缓冲液）：，含、。近红外免疫层析法检测试纸条，参数见附录。仪器设备 电子天平，感量 。便携式近红外荧光扫描仪。测定步骤 样品制备、增菌培养和分离见附录。测定吸取 样品待测液滴加到试纸条加样区，待吸收干后再滴加 缓冲液，室温放置 后，用便携式近红外荧光扫描仪分别测定所述检测线和质控线的荧光强度，激发波长 ，发射波长为 ，分析结果。犌犅犜 结果及判定若试纸条质控线区域出现荧光发射峰，则表明该试纸条有效，反之则无效；若检测线荧光扫描峰面积与质控线荧光扫描峰面积比超过阈值（阴性对照值）则为阳性结果，反之则为阴性。本方法判定为阳性结果的样品，宜参照附录中的方法或相关国际权威微生物经典检验方法进行阳性结果确证。目标区域测序法 原理样品制备、增菌培养和分离后，提取样品基因组，经过连接接头序列、扩增连接产物、探针捕获扩增产物、获得测序文库、高通量测序、分析测序数据等过程，得出检测结论。试剂和材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。文库构建试剂盒。高通量测序试剂盒。探针：符合附录。人工：符合附录。仪器设备 高通量测序仪。分光光度计。检测步骤 样品制备、增菌培养和分离见附录。提取基因组犇犖犃取培养的相应致病菌增菌液（需二次培养的则取二次增菌液）提取并纯化基因组。提取与纯化的溶液在 与 处的吸光度值的比值大于；在 与 处的吸光度值的比值介于 与 之间；电泳主带明显，无明显降解和残留。文库构建 利用文库构建试剂盒及其操作说明进行文库构建。利用酶切消化或机械破碎的方法，将待测样品和质控样品基因组片段化至 。对 中获得的产物进行末端修复并连接接头序列。接头序列应包括三个部分：约 个碱基的通用序列、个碱基组成的随机条形码序列和 个碱基的样品条形码序列。其中，不同的待测样品或质控样品使用不同的样品条形码序列，且在同一个实验室中相同的样品条形码序列在 内只使用一次。按试剂盒纯化连接产物。利用 中接头上的通用序列设计引物对 中获得的产物进行扩增，扩增循环数犌犅犜 个。其中，所设计的引物序列包含高通量测序仪的测序引物序列。纯化扩增产物。将具有不同样品条形码的待测样品或质控样品等质量混合后成为混合样品，每个混合样品中待测样品或质控样品的数目不宜超过个。将附录中的探针等摩尔质量混合，形成混合探针，利用混合探针对 中获得的产物进行杂交捕获。按试剂盒纯化捕获产物。利用高通量测序仪的测序引物序列对 中的产物进行扩增，扩增循环数 个，获得测序文库。按试剂盒纯化捕获产物。高通量测序利用高通量测序试剂盒及其操作说明对测序文库进行高通量测序，每个待测样品的测序碱基数据量设置为大于或等于 。质量控制适宜的条件下，保留一份增菌液以备结果阳性时，采用其他方法进行验证。利用软件将质控样品与待测样品的测序数据比对到参考基因组的标记位点上，获得质控样品与待测样品的成功比对的测序碱基数据量犆和犆。当犆 时，判定待测样品被污染，从 或之前的步骤开始重新实验。当犆 时，判定待测样品的测序数据量不足，从 或之前的步骤开始重新实验。当犆 且犆 时，判定测序数据合格，可以进行结果分析。结果及判定利用微生物鉴定软件统计微生物的检出标记（见附录）的数目犖，并输出判定结论。若犖，判定结论为“待测样品中不存在微生物”；若犖，判定结论为“待测样品中可能存在微生物”；若犖，判定结论为“待测样品中存在微生物”。对于结论为“待测样品中可能存在微生物”的待测样品，宜参照附录中的方法或相关的国际权威微生物经典检验方法做进一步的生化鉴定和报告。犌犅犜 附录犃（资料性）分子马达检测试剂盒参数犃 分子马达检测试剂盒分子马达检测试剂盒组成参考表。表犃 分子马达检测试剂盒组成编号组分名称数量储存条件分子马达探针溶液：致病菌 犻 狀 狏犃、狋 狅 狓犚、狆 狉 犳犃、狅犿狆犠、犐狆犪犎、犐犜犛；病毒 犎犃犞各 合成缓冲液：三（羟甲基）甲基甘氨酸（），甘油，室温二磷酸腺苷（）：缓冲液：，室温荧光素酶荧