SN∕T 5364.2-2021 出口食品中致病菌检测方法 微滴式数字PCR法 第2部分：霍乱弧菌.pdf

I C S0 7.1 0 0.3 0C C SX0 4中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 3 6 4.22 0 2 1 出口食品中致病菌检测方法微滴式数字P C R法第2部分:霍乱弧菌D r o p l e t d i g i t a l P C R m e t h o d f o r d e t e c t i o n o f p a t h o g e n s i n e x p o r t f o o dP a r t 2:V i b r i o c h o l e r a e2 0 2 1-1 1-2 2发布2 0 2 2-0 6-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。S N/T 5 3 6 42 0 2 1 出口食品中致病菌检测方法 微滴式数字P C R法 共分为8个部分:第1部分:副溶血性弧菌第2部分:霍乱弧菌第3部分:溶藻弧菌第4部分:创伤弧菌第5部分:金黄色葡萄球菌第6部分:单核细胞增生李斯特氏菌第7部分:产志贺毒素大肠埃希氏菌第8部分:克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)本文件为S N/T 5 3 6 42 0 2 1的第2部分。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中国海关科学技术研究中心、中华人民共和国天津海关、中国检验检疫科学研究院。本文件主要起草人:魏海燕、马丹、魏咏新、李丹、张西萌、徐蕾蕊、刘莉、曹佳悦、曾静、董志珍、邢仕歌、赵良娟、高飞。S N/T5 3 6 4.22 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准出口食品中致病菌检测方法微滴式数字P C R法第2部分:霍乱弧菌1 范围本文件规定了食品中总霍乱弧菌和含毒力基因霍乱弧菌的微滴式数字P C R检测方法。本文件适用于食品中总霍乱弧菌和含毒力基因霍乱弧菌的快速定性检测。本文件的检出限为1 C F U/2 5 g 5 C F U/2 5 g(或1 C F U/2 5 m L5 C F U/2 5 m L)。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法G B/T 2 7 4 0 32 0 0 8 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测S N/T 1 0 2 2 进出口食品中霍乱弧菌检验方法3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。D NA(d e o x y r i b o n u l e i c a c i d):脱氧核糖核酸。d d P C R(d r o p l e t d i g i t a l p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n):微滴式数字P C R。g b pA(G l c NA c-b i n d i n g p r o t e i n g e n e):N-乙酰葡糖胺结合蛋白A的编码基因。P C R(p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n):聚合酶链式反应。t c pA(t o x i n c o r e g u l a t e d p i l i n g e n e):毒力协同调节菌毛编码基因。5 方法原理分别针对霍乱弧菌种属特异性g b pA基因及毒力基因t c pA设计引物/探针,将一定浓度的引物、探针与模板D NA及数字P C R反应预混液混合,配成双重数字P C R反应体系。将该双重数字P C R体系分布到1 0 0 0 02 0 0 0 0个微滴中,使大部分微滴中模板D NA分子的数量为1或0,然后进行P C R扩增。g b pA基因及t c pA基因探针5 端分别标记F AM和V I C荧光基团,利用数字P C R系统的双通道检测,可同时对两个基因的荧光信号进行采集分析。根据g b pA基因及t c pA基因所对应的阳性微滴1S N/T5 3 6 4.22 0 2 1以正式出版文本为准的有无判定样品中是否含有霍乱弧菌和含毒力基因的霍乱弧菌。6 主要设备及耗材6.1 天平:感量0.1 g。6.2 均质器。6.3 恒温培养箱:3 6 1。6.4 高速台式冷冻离心机(离心力1 2 0 0 0g)。6.5 涡旋振荡仪。6.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.7 生物安全柜。6.8 d d P C R扩增仪及相关配套设备。6.9 不同量程移液器:1 0 0 L1 0 0 0 L、2 0 L2 0 0 L、1 0 L1 0 0 L、0.5 L1 0 L。6.1 0 离心管:2 m L、1.5 m L和0.2 m L。7 材料与试剂7.1 仅使用分析纯试剂和符合G B/T 6 6 8 2规定的一级水。7.2 细菌基因组提取试剂盒。7.3 d d P C R反应配套试剂。7.4 去游离核酸酶:伯乐1)。1)给出这一信息是为了方便本文件使用者,并不表示只认可该产品。如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用等效产品。7.5 阳性对照:霍乱弧菌参照菌株D NA,或含目的片段的D NA亦可。7.6 霍乱弧菌N-乙酰葡糖胺结合蛋白A的编码基因(g b pA)序列片段参见附录A.1,引物探针如下:g b pA-F:5-C AAA C C AAA C T G GAA C C C AAA-3;g b pA-R:5-T C AA C GA C A C AGAA C G GAT T G-3;g b pA-P:5-F AM-C C AT T G T C G C G T GAT G C AT T T GA C C-B HQ 1-3。7.7 霍乱弧菌毒力协同调节菌毛编码基因(t c pA)序列片段参见附录A.2,引物探针如下:t c pA-F:5-G G GAT AT G T T T C C AT T T AT C AA C G T-3;t c pA-R:5-G C GA C A C T C G T T T C GAAAT C A-3;t c pA-P:5-F AM-T G C T T T C G C T G C T G T C G C T GAT C T T-B HQ 1-3。8 检测程序食品中霍乱弧菌d d P C R检测程序见图1。2S N/T5 3 6 4.22 0 2 1以正式出版文本为准图1 食品中霍乱弧菌d d P C R检测程序9 实验操作步骤9.1 样品制备参照S N/T 1 0 2 2中方法进行样品制备和第一次选择性增菌。9.2 D N A提取直接取9.1获得的增菌液2 m L加到无菌离心管中,8 0 0 0g离心2 m i n,尽量吸弃上清;利用1 0 0 L磷酸盐缓冲液重悬沉淀,加入2 0 L去游离核酸酶,置于3 7 作用1 5 m i n 3 0 m i n,9 5 加热1 0 m i n使酶失活。继而利用细菌基因组提取试剂盒提取D NA,操作方法按试剂盒说明书进行。9.3 D N A浓度和纯度测定取适量D NA原液加双蒸水稀释一定倍数后,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定2 6 0 n m和2 8 0 n m处的吸收值,按照式(1)计算D NA的浓度。=A2 6 0N5 0(1)式中:D NA浓度,单位为微克每毫升(g/m L);A2 6 0 2 6 0 n m处的吸光值;N 核酸稀释倍数。当D NA浓度为0.1 g/m L1 0 0 g/m L,A2 6 0/A2 8 0在1.82.0之间时,适用d d P C R检测。3S N/T5 3 6 4.22 0 2 1以正式出版文本为准9.4 d d P C R检测9.4.1 对照和平行检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。以霍乱弧菌标准菌株D NA或含目的片段的D NA作为阳性对照,利用细菌基因组提取试剂盒按步骤9.2提取的大肠埃希氏菌标准菌株D NA作为阴性对照,用等体积的双蒸水代替D NA模板作为空白对照。每个待检样品提取的D NA溶液进行3个平行d d P C R检测。9.4.2 反应体系按照表1配制反应体系。表1 d d P C R反应体系试剂名称储备液浓度终浓度体积数字P C R反应预混液211 0 Lg b pA-F1 0 m o l/L0.7 5 m o l/L1.5 Lg b pA-R1 0 m o l/L0.7 5 m o l/L1.5 Lg b pA-P1 0 m o l/L0.2 5 m o l/L0.5 Lt c pA-F1 0 m o l/L0.7 5 m o l/L1.5 Lt c pA-R1 0 m o l/L0.7 5 m o l/L1.5 Lt c pA-P1 0 m o l/L0.2 5 m o l/L0.5 LD NA模板3 L体系总体积2 0 L9.4.3 微滴生成将配制好的数字P C R反应混合液,加入微滴生成装置加样孔中,按仪器操作说明生成微滴。9.4.4 d d P C R扩增将生成的微滴缓慢转移至9 6孔板中,封膜后置于P C R仪上,按以下参数进行P C R扩增:9 5 1 0 m i n(升降温速度:1/s);9 4 3 0 s(升降温速度:1/s),6 0 1 m i n(升降温速度:1/s),4 5个循环;9 8 1 0 m i n(升降温速度:1/s),4 保存反应产物。注:P C R反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。9.4.5 荧光信号读取扩增反应结束后,将9 6孔板放入d d P C R检测仪中对每个微滴进行荧光检测,采用F AM和V I C通道分别读取g b pA基因及t c pA基因扩增的荧光信号。1 0 结果分析与表述1 0.1 阈值的设定根据空白对照的终点荧光值设定阈值限,阈值限应对空白和阳性扩增结果进行明确的区分。4S N/T5 3 6 4.22 0 2 1以正式出版文本为准1 0.2 质量控制1 0.2.1 体系分隔产生的有效微滴的总数量满足所用d d P C R仪器型号要求。1 0.2.2 阴性对照和空白对照无荧光信号检出。1 0.2.3 阳性对照有荧光信号检出且阴性微滴簇与阳性微滴簇能够截然分开。1 0.2.4 以上质控条件有一项不符合者,实验结果视为无效,查找原因后再次进行d d P C R检测。1 0.3 结果表述1 0.3.1 待检样品所有微滴g b pA基因及t c pA基因对应的荧光信号均低于阈值限,待测样品中不含有霍乱弧菌,检测结果表述为“未检出霍乱弧菌”。1 0.3.2 待检样品3个平行中至少1个平行g b pA基因有荧光信号高于阈值限的阳性微滴,且阴性微滴簇与阳性 微滴簇能够 截然分开,该 样品结果 为霍乱弧菌 初 筛 阳 性,对 样 品 的 增 菌 液 进 一 步 按S N/T 1 0 2 2中的操作步骤进行确认后报告结果。1 0.3.3 满足8.3.2的情况下,若t c pA基因同时出现荧光信号高于阈值限的阳性微滴,则该样品结果为含有毒力基因的霍乱弧菌初筛阳性,对样品的增菌液进一步按S N/T 1 0 2 2中的操作步骤进行确认后报告结果。1 1 防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照G B/T 2 7 4 0 32 0 0 8中附录D的规定执行。5S N/T5 3 6 4.22 0 2 1以正式出版文本为准附 录 A(资料性)霍乱弧菌特异性基因序列片段A.1 霍乱弧菌g b pA基因序列(部分)及引物设计示意图(A c c e s s i o n N o.E U 0 7 2 4 4 1.1)见图A.1。图A.1 霍乱弧菌g b pA基因序列(部分)及引物设计示意图注:阴影部分分别为g b pA上下游引物序列,方框部分为探针序列